Detecção rápida de desenvolvimento neurológico fenótipos nas células precursoras neurais humanas (NPCs)
Summary
Desenvolvimento neurológico processos tais como consequência natural do axônio, migração e proliferação são frequentemente perturbadas em doenças neuropsiquiátricas. Assim, apresentamos protocolos para rapidamente e reproducibly avaliar estes processos de desenvolvimento neurológico em NPCs de iPSC-derivado humanos. Estes protocolos permitem também a avaliação dos efeitos da terapêutica e fatores de crescimento relevantes no desenvolvimento do NPC.
Abstract
Desenvolvimento do cérebro humano procede através de uma série de precisamente processos orquestradas, com fases anteriores distinguidos pela proliferação, migração e consequência do axônio; e estágios posteriores, caracterizados pela formação de consequência e sinapse axônio/dendrito. Em transtornos do desenvolvimento neurológico, muitas vezes um ou mais destes processos são rompidas, levando a anormalidades na formação do cérebro e função. Com o advento da tecnologia de células-tronco (hiPSC) humanas pluripotentes induzidas, os pesquisadores têm agora uma fonte abundante de células humanas que podem ser diferenciados em praticamente qualquer tipo de célula, incluindo os neurônios. Estas células podem ser usadas para estudar o desenvolvimento normal do cérebro e patogênese da doença. Um número de protocolos utilizando hiPSCs para modelar doença Neuropsiquiátrica uso terminalmente diferenciadas neurônios ou uso de sistemas de cultura 3D denominado organoids. Enquanto estes métodos provaram ser inestimáveis em estudar a patogênese de doenças humanas, existem alguns inconvenientes. Diferenciação de hiPSCs em neurônios e geração de organoids são longos e onerosos processos que podem afetar o número de experimentos e variáveis que podem ser avaliadas. Além disso, enquanto organoids e neurônios pós mitóticos permitem o estudo dos processos relacionados a doença, incluindo consequência dendrito e sinaptogênese, eles impedem o estudo de processos anteriores, como a proliferação e migração. Em transtornos do desenvolvimento neurológico, como o autismo, abundantes provas genéticas e post-mortem indicam defeitos em processos de desenvolvimento precoce. As células precursoras neurais (NPCs), uma população altamente proliferativa da célula, podem ser um modelo adequado em que perguntas sobre processos ontogenéticos e iniciação de doença. Agora estendemos metodologias aprendidas estudando desenvolvimento em camundongo e rato de culturas corticais para NPCs humanas. O uso de NPCs nos permite investigar doença relacionada com fenótipos e definir como diferentes variáveis (por exemplo, fatores de crescimento, drogas) impacto do desenvolvimento processos incluindo proliferação, migração e diferenciação em poucos dias. Em última análise, este conjunto de ferramentas pode ser usado de forma reprodutível e elevado-throughput para identificar mecanismos de doenças específicas e fenótipos em transtornos do desenvolvimento neurológico.
Introduction
A utilização de organismos mais simples e modelos de rato tem elucidados os mecanismos do desenvolvimento cerebral básica, bem como a patogênese da doença. Apesar destes avanços, a etiologia de muitos distúrbios neuropsiquiátricos continua elusiva, porque nem todos os achados em organismos mais simples são diretamente relevantes para os aspectos complexos das doenças humanas. Além disso, a maior complexidade do cérebro humano muitas vezes torna difícil para o modelo de desenvolvimento humano e distúrbios nos animais. Com a evolução e o progresso da tecnologia de células-tronco (hiPSCs) humanas pluripotentes induzidas, as células somáticas podem ser reprogramadas em células-tronco e em seguida diferenciadas em células neuronais para estudar doenças humanas. Avanços em tecnologias hiPSCs e “omic” (genômica, transcriptomics, proteômica, metabolomics) prometem revolucionar a compreensão do desenvolvimento do cérebro humano. Estas tecnologias agora tornam possível uma abordagem de “medicina de precisão” para a caracterização das doenças neuropsiquiátricas em uma base caso-a-caso.
O grampo atual no campo de modelagem de doença hiPSC é para diferenciar as células em subtipos neuronais específicos em uma monocamada ou usar um sistema de cultura 3D chamado um organoides para recapitular aspectos do cérebro desenvolvimento1,2, 3. Estes sistemas foram incrivelmente valiosos em estudando e descobrindo aspectos únicos do desenvolvimento humano e doença4,5,6,7. No entanto, tanto culturas neuronal e organoids muitas vezes exigem em qualquer lugar de semanas a meses na cultura antes de estarem prontos para estudar. A natureza demorada esses protocolos e o montante dos recursos necessários para manter que estes sistemas de cultura muitas vezes limitam o número de experiências que podem ser executadas e o número de variáveis (como fatores de crescimento ou drogas) que podem ser testados. Além disso, muitos estudos utilizando organoids e neurônios pós mitóticos concentraram-se em processos como formação de consequência ou sinapse dendrito, que ocorrem mais tarde, em desenvolvimento. Enquanto estes processos têm sido implicados na patologia dos transtornos globais do desenvolvimento como autismo e esquizofrenia, no início do desenvolvimento eventos que ocorrem antes de diferenciação neuronal definitiva também são importantes para a patogênese da doença8 ,9,10,11,12,13. De fato, estudos genômicos recentes mostram que o período de meados de-fetal, que é composto de proliferação, migração e consequência natural do processo, é particularmente importante na patogênese de autismo11,14. Assim, é importante estudar o tronco neural e populações de células progenitoras para entender melhor estes processos anteriores. Sistemas de organoides que são recapitular considerado para melhor desenvolvimento do cérebro humano devido à sua natureza 3D e estrutura organizada, contêm um pool de progenitor que tem sido utilizado para estudar alguns desses eventos anteriores. No entanto, a população do progenitor em organoids muitas vezes é escassa e mais como células gliais radiais que neural tronco ou progenitoras células5,15. Assim, seria benéfico ter um método de alto throughput para estudar os estágios iniciais de neurodesenvolvimento em uma população de células ativamente proliferativa.
No laboratório, nós criamos um protocolo que utiliza células precursoras neurais hiPSC-derivado (NPCs), uma população mista de haste neural e de células progenitoras que é altamente proliferativas, para estudar processos de desenvolvimento neurológico, como a proliferação, migração celular, e extensão do processo inicial (axônio). Estes ensaios foram desenvolvidos a partir de técnicas utilizadas em nosso laboratório durante décadas para estudar com sucesso neurodesenvolvimento em rato e rato culturas cortical16,17,18,19,20, 21,22,23. Importante, também foi mostrado que fenótipos e sinais regulamentares definidos nos sistemas de cultura de rato e rato são altamente preditivos dos mecanismos que estão ativos na vivo, indicando o valor destas técnicas16, 17,18,19,24. Após a diferenciação inicial de hiPSCs para NPCs, estes métodos permitem estudar processos de desenvolvimento vitais, em questão de dias. Esses métodos têm muitas vantagens: (1) exigem equipamentos pouco sofisticados e são fáceis de implementar, (2) numerosas repetições experimentais podem ser realizadas em um curto período de tempo, permitindo a rápida confirmação da reprodutibilidade dos resultados e (3) variáveis de cultura como matrizes de revestimento, os efeitos de fatores de crescimento e atividade de fármacos podem ser testadas de forma rápida e econômica. Além disso, aproveitamos o papel bem estabelecido extracelulares de fatores de crescimento como reguladores da críticos dos diversos processos de desenvolvimento. NPCs foram expostos para selecionar sinais do desenvolvimento que diretamente estimulam eventos como consequência de axônio, proliferação e migração celular e tem encontrado que eles aprimoram a capacidade de identificar defeitos que não são aparentes em condições de controle19 , 25 , 26 , 27 , 28. da mesma forma, a facilidade de avaliar drogas fornece uma poderosa Avenida para adotar técnicas de medicina de precisão para testar a eficácia de diversas intervenções terapêuticas. Assim, este protocolo facilita um alto throughput, reprodutível e uma metodologia simples para estudar o desenvolvimento precoce do cérebro, patogênese da doença e os potenciais efeitos benéficos de drogas e fatores de crescimento no desenvolvimento neurológico fenótipos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos apresentados aqui ilustram métodos rápidos e simples para estudar processos fundamentais de desenvolvimento neurológico e testar drogas usando células precursoras neurais derivadas hiPSC e fatores de crescimento. hiPSC tecnologia revolucionou o estudo da patogênese de doenças do desenvolvimento neurológico, fornecendo-em um acesso sem precedentes para viver humanas células neuronais de indivíduos afetados. De fato, há inúmeros estudos de hiPSC de transtornos de desenvolvimento neurológico, inclu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Conselho do governador de Nova Jersey para pesquisas médicas e tratamento de autismo (CAUT13APS010; CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie marca fundação familiar, Mindworks Charitable Trust de chumbo e a Fundação da comunidade judaica de maior MetroWest NJ.
Materials
| PSC Neural Induction Medium: Protocol Link: https://goo.gl/euub7a |
ThermoFischer Scientific | A1647801 | This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium |
| Advanced DMEM/F12 Medium | ThermoFischer Scientific | 12634-010 | Component of 100% Expansion Medium |
| Neurobasal Medium | ThermoFischer Scientific | 21103049 | Component of both NIM and 100% Expansion Medium |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) |
| Y-27632 (2HCl), 1 mg | Stem Cell Technologies | 72302 | ROCK inhibitor |
| 6 well plates | Corning | COR-3506 | Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay |
| 24 well plates | ThermoFischer Scientific | 2021-05 | Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay |
| 35 mm dishes | ThermoFischer Scientific | 2021-01 | Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | Substrate for coating plates |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific | 15140122 | Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | 1X Cell Detachment Solution |
| 2.5% Trypsin (10X) | Gibco | 15090-046 | 10X enzymatic solution |
| 0.5 M EDTA | ThermoFischer Scientific | AM9261 | used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay |
| tritiated [3H]-thymidine | PerkinElmer | NET027E001 | Radioactive tritium, thymidine |
| Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-1 | Vials for liquid scintillation counting |
| EcoLite(+) | MP Biomedicals | 0188247501 | Liquid scintillation cocktail |
| LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter | Beckman Coulter | 8043-30-1194 | Liquid Scintillation Counter |
| Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 | Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. | Semi-automatic cell harvester | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit | ThermoFisher Scientific | C10337 | EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | Assessing viability of cells |
| Grade GF/C filter paper | GE Healthcare Life Sciences, Whatman | 1822-849 | Glass fiber filter paper |
| Human Basic FGF-2 | Peprotech | 100-18B | growth factor |
| Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) | BACHEM | H-8430 | neuropeptide |
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