Schnelle Erkennung von Entwicklungsstörungen Phänotypen in menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (NPCs)
Summary
Neurodevelopmental Prozesse wie Proliferation, Migration und Neurit Auswuchs bei neuropsychiatrischen Erkrankungen oft gestört sind. So präsentieren wir Protokolle, um schnell und reproduzierbar Diese Entwicklungsstörungen Prozesse im menschlichen iPSC-abgeleitete NPCs zu beurteilen. Diese Protokolle ermöglichen auch die Bewertung der Auswirkungen der relevanten Wachstumsfaktoren und Therapeutika auf NPC-Entwicklung.
Abstract
Die Entwicklung des menschlichen Gehirns durchläuft eine Reihe von genau orchestrierte Prozessen mit früheren Stadien zeichnen sich durch Proliferation, Migration und Neurit Auswuchs; und spätere Phasen geprägt von Axon/Dendrit Auswuchs und Synapse Bildung. In Neuroentwicklungsstörungen sind oft eine oder mehrere dieser Prozesse gestört führt zu Anomalien im Gehirn Bildung und Funktion. Mit dem Aufkommen der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Technologie haben Forscher nun ein reichhaltiges Angebot an menschlichen Zellen, die in nahezu jedem Zelltyp, einschließlich Neuronen unterschieden werden können. Diese Zellen können verwendet werden, um normale Gehirnentwicklung und Pathogenese der Krankheit zu studieren. Eine Reihe von Protokollen mit HiPSCs, neuropsychiatrische Krankheit Verwendung unheilbar zu modellieren differenzierten Neuronen oder 3D Culture Nutzungssysteme als Organellen bezeichnet. Während diese Methoden bei der Untersuchung der Pathogenese der Krankheit beim Menschen von unschätzbarem Wert erwiesen haben, gibt es einige Nachteile. Differenzierung der HiPSCs in Neuronen und Generierung von Organellen sind langwierige und kostspielige Prozesse, die Auswirkungen haben können, dass die Anzahl der Experimente und Variablen, die beurteilt werden können. Darüber hinaus während Post-mitotische Neuronen und Organellen die Untersuchung von krankheitsbezogenen Prozessen ermöglichen, einschließlich Dendrit Auswuchs und Synaptogenese, schließt sie die Studie von früheren Prozessen wie Proliferation und Migration. In Neurodevelopmental Störungen wie Autismus gibt reichliche Beweise für genetische und Post-Mortem-Mängel im frühen Entwicklungsprozessen. Neurale Vorläuferzellen (NPCs), eine hohe proliferative Zellpopulation, möglicherweise ein geeignetes Modell, um Fragen über ontogenetische Prozesse und Krankheit Einleitung. Wir erweitern nun Methoden daraus gelernt Entwicklung bei Maus und Ratte kortikale Kulturen an menschliche NPCs. Die Verwendung von NPCs kann wir untersuchen krankheitsbezogenen Phänotypen und definieren, wie die verschiedenen Variablen (z.B., Wachstumsfaktoren, Drogen) Auswirkungen Entwicklungsprozesse einschließlich Proliferation, Migration und Differenzierung in nur wenigen Tagen. Letztlich kann dieses Toolset in gewissem Sinne reproduzierbar und hohem Durchsatz zur krankheitsspezifische Mechanismen und Phänotypen in Neuroentwicklungsstörungen zu identifizieren.
Introduction
Die Verwendung von einfacher Organismen und Maus-Modellen hat die Mechanismen der grundlegenden Gehirnentwicklung sowie Pathogenese der Krankheit aufgeklärt. Trotz dieser Fortschritte bleibt die Ätiologie der vielen neuropsychiatrischen Störungen schwer, weil nicht alle Befunde in einfacheren Organismen direkt für komplexe Aspekte der Krankheit beim Menschen relevant sind. Darüber hinaus die größere Komplexität des menschlichen Gehirns oft macht es schwierig, Modell menschlicher Entwicklung und Erkrankungen bei Tieren. Mit der Entwicklung und der Fortschritt der menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) Technologie können Körperzellen an Stammzellen umprogrammiert und dann differenziert in neuronalen Zellen, menschlichen Krankheiten zu studieren. Fortschritte in der HiPSCs und “Omic” (Genomik, Transkriptom, Proteomik, Metabolomik) versprechen, das Verständnis der Entwicklung des menschlichen Gehirns zu revolutionieren. Diese Technologien ermöglichen nun einen “Präzisionsmedizin” Ansatz zur Charakterisierung der neuropsychiatrischen Erkrankungen auf einer Schachtel-durchschachtel Grundlage.
Die aktuellen Heftklammer im Feld HiPSC Krankheit-Modellierung ist es, Zellen in bestimmten neuronalen Subtypen in einem monomolekularen Film zu unterscheiden oder eine 3D Culture-System namens eine organoide verwenden, um Aspekte des Gehirns Entwicklung1,2zu rekapitulieren, 3. Diese Systeme wurden unglaublich wertvoll im Studium und die Aufdeckung der einzigartigen Aspekte der menschlichen Entwicklung und Krankheit4,5,6,7. Erfordern jedoch neuronalen Kulturen und Organellen oft überall von Wochen bis Monate in Kultur bevor sie bereit sind zu lernen. Die aufwändige Art der diese Protokolle und die Menge an Ressourcen benötigt um zu halten, dass diese Systeme oft zu begrenzen, die Zahl der Versuche, die durchgeführt werden können und die Anzahl der Variablen (wie Wachstumsfaktoren oder Drogen), die getestet werden können. Darüber hinaus haben viele Studien, die Verwendung von Post-mitotische Neuronen und Organellen auf Prozesse wie Dendrit Auswuchs oder Synapse Bildung, konzentriert, die später in der Entwicklung auftreten. Während dieser Prozesse in der Pathologie des Entwicklungsstörungen wie Autismus und Schizophrenie verwickelt waren, sind früher Entwicklungsstörungen Ereignisse, die vor dem endgültigen neuronaler Differenzierung auftreten auch wichtig für die Pathogenese der Krankheit8 ,9,10,11,12,13. In der Tat zeigen den letzten genomische Studien, dass der Mitte fötale Periode, die Verbreitung, Prozess Auswuchs und Migration besteht, besonders wichtig bei Autismus Pathogenese11,14 ist. So ist es wichtig zu untersuchen, neurale Stammzellen und Vorläuferzellen Zellpopulationen zu diesen früheren Vorgänge besser zu verstehen. Organoide Systeme, die als bessere Zusammenfassend menschlichen Gehirnentwicklung wegen ihrer 3D Natur und organisierte Struktur sind, enthalten einen Stammvater Pool, der verwendet worden ist, um einige dieser früheren Ereignisse zu untersuchen. Jedoch die Stammvater Bevölkerung in Organellen ist oft spärlich und eher wie radiale Gliazellen als neuronale Stammzellen und Vorläuferzellen Zellen5,15. Daher wäre es vorteilhaft, eine Hochdurchsatz Methode zur frühe Stadien von Neurodevelopment in einem aktiv proliferativer Zellpopulation zu studieren.
Im Labor haben wir eine Protokoll das HiPSC abgeleitet neuronalen Vorläuferzellen (NPCs), eine gemischte Bevölkerung von neuronalen Stammzellen und Vorläuferzellen hoch proliferative verwendet, Entwicklungsstörungen Prozesse wie Proliferation, Zellmigration, zu studieren und Startvorgang (Neuriten) Verlängerung. Diese Tests wurden von Techniken, die in unserem Labor seit Jahrzehnten erfolgreich studieren Neurodevelopment in Ratte und Maus kortikale Kulturen16,17,18,19,20entwickelt, 21,22,23. Wichtiger ist, es wurde auch gezeigt, dass Phänotypen und regulatorische Signale definiert in der Ratte und Maus Kultur hoch prädiktive Mechanismen aktiv in Vivo sind, die den Wert dieser Techniken16, 17,18,19,24. Nach anfänglichen Differenzierung der HiPSCs mit NPCs erlauben diese Methoden uns, wichtige Entwicklungsprozesse in wenigen Tagen zu studieren. Diese Methoden haben viele Vorteile: (1) sie erfordern wenig anspruchsvolle Geräte und sind einfach zu implementieren, (2) zahlreiche experimentelle Wiederholungen durchgeführt werden können, in kurzer Zeit, so dass für die schnelle Bestätigung die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und (3) Kultur-Variablen wie Beschichtung Matrizen, Effekte von Wachstumsfaktoren und Tätigkeit der Drogen können schnell und kostengünstig getestet werden. Darüber hinaus nutzen wir die etablierten Rolle von extrazellulärer Wachstumsfaktoren als wichtige Regulatoren der unterschiedlichen Entwicklungsprozessen. NSCs wurden ausgesetzt, um Entwicklungsstörungen Signale auswählen, die direkt Veranstaltungen wie Proliferation, Neurit Auswuchs und Zellwanderung zu stimulieren, und haben festgestellt, dass sie zur Verbesserung der Fähigkeit, Mängel zu identifizieren, die nicht offensichtlich im Steuerelement Bedingungen19 , 25 , 26 , 27 , 28. ebenso die einfache Bewertung von Medikamenten bietet eine leistungsstarke Allee um Präzision-Medizin-Techniken um zu testen, die Wirksamkeit verschiedener therapeutischer Interventionen zu übernehmen. Dieses Protokoll ermöglicht so ein hoher Durchsatz, reproduzierbar, und einfache Methode zur frühen Entwicklung des Gehirns, Pathogenese der Krankheit und der potenziellen vorteilhaften Wirkungen von Wachstumsfaktoren und Drogen auf Entwicklungsstörungen Phänotypen zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellten Protokolle zeigen, schnelle und einfache Methoden, um grundlegende Neurodevelopmental Prozesse zu studieren und Wachstumsfaktoren und Drogen mit HiPSC abgeleitet neuronalen Vorläuferzellen zu testen. HiPSC Technologie hat die Untersuchung der Pathogenese von Entwicklungsstörungen Krankheiten revolutioniert, indem wir uns mit noch nie da gewesenen Zugang zu menschlichen Nervenzellen von betroffenen Personen leben. In der Tat gab es zahlreiche HiPSC Studien von Entwicklungsstörungen des Rett-Syndr…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Gouverneur von New Jersey Rat für medizinische Forschung und Behandlung von Autismus (CAUT13APS010; unterstützt. CAUT14APL031; CAUT15APL041), Nancy Lurie markiert Familienstiftung, Coverversion Charitable Lead Trust und der jüdischen Gemeinde-Stiftung von größeren MetroWest NJ.
Materials
| PSC Neural Induction Medium: Protocol Link: https://goo.gl/euub7a |
ThermoFischer Scientific | A1647801 | This is a kit that consists of Neurobasal (NB) medium and a 50x Neural Induction Supplement (NIS). The NIS is used to make 1X Neural Induction Medium and 100% Expansion Medium |
| Advanced DMEM/F12 Medium | ThermoFischer Scientific | 12634-010 | Component of 100% Expansion Medium |
| Neurobasal Medium | ThermoFischer Scientific | 21103049 | Component of both NIM and 100% Expansion Medium |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | hESC-qualified extracellular matrix-mimic gel (ECM-mimic gel) |
| Y-27632 (2HCl), 1 mg | Stem Cell Technologies | 72302 | ROCK inhibitor |
| 6 well plates | Corning | COR-3506 | Polystyrene plates used for NPC maintenance and for Neurosphere Migration Assay |
| 24 well plates | ThermoFischer Scientific | 2021-05 | Polystyrene plates: Used for NPC DNA Synthesis Assay |
| 35 mm dishes | ThermoFischer Scientific | 2021-01 | Polystyrene plates: Used for NPC S-Phase Entry and Neurite Assay |
| Natural Mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | Substrate for coating plates: Used for NPC DNA Synthesis, S-Phase Entry, and Cell Number Assays |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | Substrate for coating plates: Used for Neurite Assay |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | Substrate for coating plates |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer Scientific | 15140122 | Antibiotic, component of NIM, 100% Expansion and 30% Expansion Media |
| StemPro Accutase | Gibco | A11105-01 | 1X Cell Detachment Solution |
| 2.5% Trypsin (10X) | Gibco | 15090-046 | 10X enzymatic solution |
| 0.5 M EDTA | ThermoFischer Scientific | AM9261 | used in trypsin solution for lifting cells for DNA synthesis assay |
| tritiated [3H]-thymidine | PerkinElmer | NET027E001 | Radioactive tritium, thymidine |
| Fisherbrand 7 mL HDPE Scintillation Vials | Fisherbrand | 03-337-1 | Vials for liquid scintillation counting |
| EcoLite(+) | MP Biomedicals | 0188247501 | Liquid scintillation cocktail |
| LS 6500 multi-purpose liquid scintillation counter | Beckman Coulter | 8043-30-1194 | Liquid Scintillation Counter |
| Skatron Semi-automactic Cell Harvester Type 11019 | Molecular Devices & Skatron Instruments, Inc. | Semi-automatic cell harvester | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor® 488 Imaging Kit | ThermoFisher Scientific | C10337 | EdU and staining kit for S-Phase Entry Assay |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | Assessing viability of cells |
| Grade GF/C filter paper | GE Healthcare Life Sciences, Whatman | 1822-849 | Glass fiber filter paper |
| Human Basic FGF-2 | Peprotech | 100-18B | growth factor |
| Pituitary Adenylate Cyclase Activating Polypeptide (PACAP-38) | BACHEM | H-8430 | neuropeptide |
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