في المختبر تحليل سومويليشن لدراسة النشاط ليجاسى E3 السومو
Summary
خلافا ليجاسيس أوبيكويتين، حددت القليلة سومو E3 ليجاسيس. هذا المعدل في المختبر البروتوكول سومويليشن غير قادرة على تحديد رواية E3 سومو ligases بمقايسة إعادة تشكيل في المختبر .
Abstract
تعديل صغير مثل ubiquitin المعدل (سومو) هو تعديل بوستترانسلاشونال هامة (PTM) الذي يتوسط توصيل الإشارة أساسا عن طريق تحوير تفاعلات البروتين البروتين. مماثلة لتعديل أوبيكويتين، سومويلاتيون من إخراج سلسلة متتابعة إنزيم منها E1-تفعيل إنزيم (SAE1/SAE2) وإنزيم E2-تصريف الأفعال (Ubc9) و E3-ليجاسى (أيالأسرة PIAS، RanBP2 و Pc2). يختلف عن أوبيكويتينيشن، ليجاسى E3 غير الضروري لرد فعل ولكن لا توفر الدقة والفعالية لتصريف السومو. يمكن تحديد البروتينات تعديله من قبل سومويليشن في فيفو مقايسة عبر إيمونوبريسيبيتيشن مع الأجسام المضادة الخاصة بالركيزة وإيمونوبلوتينج مع الأجسام المضادة سومو محددة. ومع ذلك، يتطلب مظاهرة E3 سومو البروتين ليجاسى النشاط في المختبر إعادة تشكيل لفحوصات سومويليشن باستخدام الإنزيمات المنقي والركيزة، والبروتينات السومو. منذ في ردود الفعل في المختبر ، عادة ما SAE1/SAE2 و Ubc9، وحدها كافية لتصريف سومو، تعزيز سومويلاتيون ليجاسى E3 المفترضة ليست دائماً سهلة الكشف. هنا، نحن تصف معدلة في المختبر سومويليشن بروتوكول يحدد استمرار تعديل سومو استخدام نظام في المختبر إعادة تشكيل. بروتوكول خطوة بخطوة لتنقية حفازة نشطة ك-“bzip”، ليجاسى سومو-2/3 E3 فيروسية، يرد أيضا. أنشطة سومويليشن المنقي ك-“bzip” ترد في p53، هدفا السومو معروفة جيدا. لا يمكن فقط استخدام هذا البروتوكول عملية لتوضيح الرواية E3 سومو ليجاسيس، ولكن أيضا للكشف عن خصوصيتها بارالوج “سومو”.
Introduction
في البداية اعتبرت التعديل سومو تعديل بوستترانسلاشونال عكسها (PTM) الذي ينظم البروتين الاستقرار1. وبالإضافة إلى الاقتران المباشر، يمكن أيضا إرفاق السومو لبروتين من خلال التفاعل غير التساهمية سومو التفاعل زخارف (سيمز)2. مشابه لربط تيروسيل-الفسفرة من جزيئات إيواء Src التماثل 2 (SH2) أو ملزمة فوسفوتيروسيني (PTB) المجالات3،4، تعديل سومو يوفر منبرا تفاعل إضافي لانتقائية توظيف المحتوية على سيم المستجيب البروتينات5،6. بالإضافة إلى تنظيم توصيل الإشارة، تخدم سومويليشن عوامل النسخي والكروماتين يعيد البناء الجزيئات تعدل التعبير الجيني7،8. وأظهرت الدراسات على نطاق الجينوم سومويليشن أنماط أن التعديل سومو يرتبط ب إيجابية9،10 أو سلبية10،11،النسخ12 التنظيم، جزئيا بسبب خصوصية بارالوجوي سومويلاتيون.
وهناك ثلاثة isoforms السومو الكبرى للبروتين التصريف الحالي في خلايا الثدييات؛ وتشمل هذه سومو-1، وعالية مثلى سومو-2 سومو-3 (المشار إليها سومو-2/3)13. هو عادة مترافق السومو لبقايا يسين (ك) داخل فكرة توافق الآراء ψKxD/ه في البروتين الهدف. شريحة في ligases E3 سومو مسؤولة عن خصوصية بارالوجوي14. خلافا أوبيكويتينيشن المسارات التي تحتوي على مئات E3 ligases، كانت هناك فقط بضع E3 سومو ligases حددت15. سومو E3 ligases تتحدد بخصائص بما في ذلك قدرتها على (ط) ربط Ubc9 و (ثانيا) ربط moiety السومو عبر مجال سيم (ثالثا) تعزيز نقل السومو من Ubc9 على الركازة. غير مطلوب على الإطلاق ل تصريف سومو16ليجاسى E3، ولكن يوفر الركيزة وخصوصية سومو-بارالوجوي. منذ عادة فقط جزء صغير من الركازة مجموع البروتين تعديل سومو، الكشف عن سومويلاتيد البروتينات في فيفو دائماً تحديا. ولذلك، هناك حاجة إلى فحوصات دقيقة واستنساخه بغية توضيح الدالة دقيقة لتعديل السومو.
في المختبر الإنزيم سومويليشن، الذي يقوم بتقييم قدرة Ubc9 المنقي لتحفيز سومويليشن بروتينات الركازة، مقايسة مقبولة تماما لدراسة تعديل سومو17. ومع ذلك، E3 سومو ليجاسى النشاط في معظم الحالات لا يمكن الكشف عنها أو يمكن فقط اكتشاف مع تحور سومو ليجاسى مع نشاط ليجاسى E3 سومو عالية وخصوصية الركازة منخفضة ببروتوكول قياسي بسبب وجود كمية وفيرة من Ubc918 . النجاح الشامل لهذا الفحص يعتمد إلى حد كبير على معايرة دقيقة لتنقية Ubc9. يتم تعديل في المختبر سومويلاتيون المقايسة الموصوفة هنا من سومويلاتيون قياسية البروتوكول (انظر الجدول للمواد). ملاحظة زيادة تعديل سومو العالمية أثناء تنشيط هربس ساركومه كابوزي المرتبطة (كشف) حدا بنا إلى تحديد ليجاسى E3 سومو الفيروسية التي قد تكون مسؤولة عن المتابعة-تنظيم سومويلاتيون. وعقب عرض صغيرة من البروتينات المتفاعلة من الفيروسية E3 سومو ليجاسى ك-“bzip”، اعتبرت p53 الركازة رواية. في هذا البروتوكول، نعرض بالتفصيل في خلايا الحشرات الخطوات التي تشارك في التعبير وتنقية من البرية من نوع ك “bzip”، ليجاسى E3 سومو فيروسية مع خصوصية سومو-2/3. يتم تقييم قدرة المنقي ك-“bzip” لتعزيز سومويلاتيون p53، ركيزة سومو معروفة، حضور المبالغ المخفضة للإنزيمات E1 و E2. استخدام هذا الإنزيم سومويليشن المعدلة، يمكن تعريف الباحثين موثوق بها قدرات ليجاسى السومو E3 لرواية سومويلاتي أو ركائز معروفة، وخطوة أساسية في دراسة البروتين سومويليشن. وعلاوة على ذلك، يساعد هذا الأسلوب تحديد رواية E3 سومو ligases مع النشاط ليجاسى منخفضة ولكن خصوصية الركازة عالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في المختبر بروتوكول سومويليشن الموصوفة هنا بشكل روتيني يستخدم لإنشاء مركز سومويليشن من ركائز Ubc9 التي تم تحديدها. القيد الرئيسي استخدام بروتوكول قياسي لدراسة وظيفة سومويلاتيون ليجاسى السومو E3 هو الوفرة من تفعيل E1 السومو والأنزيمات Ubc9 E2 التصريف إلى أقصى حد على تصريف السومو في النظم <em…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من وزارة العلوم والتكنولوجيا (105-2320-B-010-007-MY3 معظم، أن المجلس المركزي الفلسطيني)، والمعهد الوطني للبحوث الصحية (المؤسسات الوطنية-EX105-10215BC للمجلس المركزي الفلسطيني)، ومن وزارة العلوم والتكنولوجيا (الأكثر 105-2314-ب-400-019 على هيك) ومن معهد بحوث الصحة الوطنية (المؤسسات الوطنية ملغ-105-س-10، مؤسسة وطنية ملغ-106-س-10 إلى هيك). وأيد هذا العمل جزئيا مع جامعة يانغ مينغ الوطنية على نشر المخطوطات للمجلس المركزي الفلسطيني. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو الجبر من المخطوطة.
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
Riferimenti
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII–a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
