In Vitro Dosage de SUMOylation pour étudier l’activité de Ligase E3 SUMO
Summary
Contrairement à l’ubiquitine ligases, quelques ligase E3 SUMO ont été identifiés. Ce modifié in vitro SUMOylation protocole est capable d’identifier de nouveaux SUMO E3 ligases par un essai de reconstitution in vitro .
Abstract
Modification de petite ubiquitin-comme modificateur (SUMO) est une importante modification poteau-de translation (PTM) qui intervient dans la transduction du signal principalement par le biais d’interactions protéine-protéine de modulation. Semblable à la modification de l’ubiquitine, SUMOylation est réalisée par une cascade enzymatique séquentielle dont E1-activation enzymatique (SAE1/SAE2), enzyme de conjugaison E2 (Ubc9) et E3-ligase (c.-à-d., famille PIAS, RanBP2 et Pc2). Cependant, différent de l’ubiquitination, une ligase E3 n’est pas essentiel pour la réaction, mais ne fournissent la précision et l’efficacité pour la conjugaison de SUMO. Protéines modifiées par SUMOylation peuvent être identifiés par l’essai in vivo avec par immunoprécipitation avec des anticorps spécifiques substrat et immunoblotting avec des anticorps spécifiques à SUMO. Toutefois, la démonstration de l’activité protéine SUMO E3 ligase exige en vitro reconstitution de SUMOylation dosages utilisant des enzymes purifiées, substrat et protéines SUMO. Étant donné que dans les réactions in vitro , habituellement SAE1/SAE2 et Ubc9, seuls sont suffisants pour la conjugaison de SUMO, amélioration de SUMOylation par une ligase E3 putative n’est pas toujours facile à détecter. Nous décrivons ici une mis à jour le in vitro SUMOylation protocole qui identifie toujours modification de SUMO à l’aide d’un système in vitro reconstitué. Un protocole étape par étape pour purifier catalytiquement active K-bZIP, une ligase E3 SUMO-2/3 virale, est également présenté. Les activités de SUMOylation de la K-bZIP purifiée figurent sur p53, un objectif bien connu de SUMO. Ce protocole peut être utilisé non seulement pour élucider roman SUMO E3 ligases, mais aussi pour avoir révélé leur spécificité paralogue SUMO.
Introduction
Modification de SUMO a été initialement identifiée comme une modification post-traductionnelle réversible (PTM) qui régule la stabilité protéique1. En plus de la conjugaison directe, SUMO peut être attaché à une protéine par l’intermédiaire des interactions non covalentes par SUMO interaction motifs (SIMs)2. Similaire à la liaison de tyrosyl-phosphorylation par les molécules d’héberger l’homologie Src 2 (SH2) ou la liaison de la phosphotyrosine (PTB) domaines3,4, modification de SUMO fournit une plateforme d’interaction additionnelle pour sélective recrutement de SIM contenant effecteur protéines5,6. En plus de la réglementation de la transduction du signal, SUMOylation de facteurs de transcriptionnelles et de molécules de remodelage de la chromatine servent à moduler l’expression de gène7,8. Études de schémas de SUMOylation pangénomique ont révélé que modification de SUMO est associée de positif9,10 ou négative10,11,12 transcription Règlement, en partie en raison de la spécificité de paralogue de SUMOylation.
Il existe trois principales isoformes SUMO pour protéine conjugaison présent dans les cellules de mammifères ; Il s’agit de SUMO-1 et le très homologues SUMO-2 et le SUMO-3 (dénommé SUMO-2/3)13. SUMO est généralement conjugué au résidu lysine (K) dans le motif de ψKxD/E consensus dans la protéine cible. La carte SIM dans le SUMO E3 ligases est responsable de la spécificité de paralogue14. Contrairement aux voies de l’ubiquitination contenant des centaines de E3 ligases, ont été signalés quelques SUMO E3 ligases identifiés15. Ligase E3 SUMO est définies par les propriétés, y compris leur capacité à (i) lier Ubc9, (ii) se lient portion SUMO via un domaine SIM et (iii) améliorer le transfert de SUMO de Ubc9 sur substrat. Ligase E3 n’est pas absolument requis pour SUMO conjugaison16, mais fournit le substrat et la spécificité de SUMO-paralogue. Depuis habituellement seulement une petite fraction de la protéine substrat total est modifié SUMO, détection de protéines SUMOylated en vivo est toujours un défi. Par conséquent, les dosages exacts et reproductibles sont nécessaires afin d’élucider la fonction précise de modification du SUMO.
L’ in vitro SUMOylation test, qui évalue la capacité de Ubc9 purifié de catalyser la SUMOylation de substrats protéiques, est un dosage reconnu pour l’étude de SUMO modification17. Toutefois, l’activité ligase E3 SUMO dans la plupart des cas ne peuvent pas être détectée ou ne peut être détectée avec muté ligase SUMO avec forte activité de ligase E3 SUMO et de spécificité de substrat faible par le protocole standard en raison de la présence d’une quantité abondante de Ubc918 . La réussite de ce test dépend en grande partie le titrage prudent de Ubc9 purifié. L’essai in vitro SUMOylation avec décrite ici est modifié par rapport à une norme SUMOylation protocole (voir Table des matières). L’observation des modification de SUMO mondiale accrue au cours de la réactivation de l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV) nous a amenés à identifier la ligase E3 SUMO virale qui peut-être être responsable de la régulation de SUMOylation. Après une projection à petite échelle des protéines interagissants de viral SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 a été identifié comme un nouveau substrat. Dans ce protocole, nous montrent en détail dans les étapes impliquées dans l’expression et purification de type sauvage K-bZIP, une ligase E3 SUMO virale avec spécificité SUMO-2/3 des cellules d’insecte. La capacité de la K-bZIP purifiée afin d’améliorer la SUMOylation de p53, un substrat bien connu de SUMO, est évaluée en présence de quantités réduites d’enzymes E1 et E2. À l’aide de ce test de SUMOylation modifié, chercheurs peuvent sûrement définissent les capacités de ligase E3 SUMO SUMOylate roman ou substrats connus, qui est une première étape dans l’étude des protéines SUMOylation. En outre, cette méthode permet d’identifier les nouveaux SUMO E3 ligases avec activité de ligase faible mais la spécificité de substrat de haute.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ in vitro SUMOylation protocole décrit ici régulièrement sert à établir le statut de SUMOylation de substrats de Ubc9 identifiés. La limitation majeure en utilisant le protocole standard utilisé pour étudier la fonction de SUMOylation de ligase E3 SUMO est l’abondance de SUMO E1 activation et enzymes de conjugaison E2 Ubc9 qui maximisent la conjugaison de SUMO dans des systèmes in vitro . Compte tenu de ce défi, nous croyons que par titrage de la quantité d’enzymes SUMO E1 et E2 au nive…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la ministère des sciences et de la technologie (MOST, 105-2320-B-010-007-MY3 au PCC), de l’Institut National de recherche en santé (INRH-EX105-10215BC au PCC), du ministère de la Science et technologie (plus 105-2314-B-400-019 à HJK) et de la National Health Research Institute (INRH MG-105-SP-10, INRH MG-106-SP-10 au HJK). Ce travail a été également soutenu en partie avec l’Université nationale Yang-Ming sur publication du manuscrit de PCC. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou réparation du manuscrit.
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
Riferimenti
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