생체 외에서 스모 E3 리가 활동 공부 SUMOylation 분석 결과
Summary
유비퀴틴 ligases와 달리 몇 E3 스모 ligases가 확인 되었습니다. 이 수정 된 생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 생체 외에서 재구성 분석 결과 의해 소설 스모 E3 ligases를 확인 할 수 있다.
Abstract
작은 유비퀴틴-같은 한정자 (스모) 수정 신호 변환 단백질 단백질 상호 작용에 변조를 통해 주로 중재 하는 중요 한 포스트 번역 상 수정 (PTM) 이다. 유비퀴틴 수정 마찬가지로 SUMOylation E1 활성화 효소 (SAE1/SAE2), e 2-활용 효소 (Ubc9), 및 E3-리가 (즉, PIA 가족, RanBP2, 및 Pc2)을 포함 하 여 순차적 효소 캐스케이드 감독 이다. 그러나, 다른 ubiquitination, E3 리가 비 본질적인 반응 하지만 않습니다 스모 활용에 대 한 정밀도 효능을 제공. 단백질 SUMOylation 수정 기판 특정 항 체와 스모 특정 항 체와 immunoblotting vivo에서 immunoprecipitation 통해 분석 하 여 확인할 수 있습니다. 그러나, 단백질 스모 E3 리가 활동의 데모 SUMOylation 분석 실험을 사용 하 여 정제 효소, 기질, 그리고 스모 단백질의 생체 외에서 재구성을 해야 합니다. 때문에 체 외에 반응에서 일반적으로 SAE1/SAE2 및 Ubc9, 혼자 스모 활용에 대 한 충분 한, putative E3 리가 여 SUMOylation의 향상은 항상 검출 하기 쉽지. 여기, 우리는 수정 된 생체 외에서 스모 수정에서 시험관에 재구성 시스템을 사용 하 여 일관 되 게 식별 SUMOylation 프로토콜 설명 합니다. 바이러스 성 스모-2/3 E3 리가 K bZIP 촉매로 활성 정화 단계 프로토콜도 제공 됩니다. 순화 K bZIP의 SUMOylation 활동 p53, 스모의 잘 알려진 대상에 표시 됩니다. 이 프로토콜 없습니다만 사용할 수 있습니다 elucidating 소설 스모 E3 ligases, 뿐만 아니라 그들의 스모 paralog 특이성을 공개.
Introduction
스모 수정 처음 단백질 안정성1을 조절 하는 가역 포스트 번역 상 수정 (PTM)으로 확인 되었습니다. 뿐만 아니라 직접 활용, 스모도 장착할 수 비 공유 상호 작용을 통해 단백질에 스모 상호 작용 주제 (심즈)2. Tyrosyl-Src 상 동 2 (SH2)를 은닉 하는 분자에 의해 인 산화의 바인딩 또는 phosphotyrosine 바인딩 (PTB) 도메인3,4, 스모 수정 제공 위한 추가 상호 플랫폼 선택 포함 하는 SIM effector 단백질5,6모집 신호 변환의 규칙, 이외에 transcriptional 요인과 분자를 개장 하는 chromatin의 SUMOylation 조절 유전자 식7,8을 제공 합니다. 게놈 넓은 SUMOylation 패턴의 연구는 스모 수정은 긍정적인9,10 또는 음수10,11,12 전사와 관련 된 공개 규칙, SUMOylation의 paralogue 특이성 때문에 부분에서.
포유류 세포; 현재 변화 하는 단백질에 대 한 세 가지 주요 스모 isoforms는 스모-1, 그리고 높은 동종 스모 2와 스모-3 (스모-2/3 라고 함)13포함 됩니다. 스모는 대상 단백질에 ψKxD/E 합의 모티브 내 lysine (K) 잔류물에 일반적으로 활용 된다. 스모 E3 ligases에서 시뮬레이션 paralogue 특이성14에 대 한 책임은. E3 ligases의 수백을 포함 하는 ubiquitination 경로, 달리만 있었다 몇 스모 E3 ligases 식별15. 스모 E3 ligases (i) 바인딩 Ubc9, (ii) SIM 도메인 통해 스모 moiety 바인딩 (iii) 기판에 Ubc9에서 스모 전송 향상을 자신의 능력을 포함 하는 속성에 의해 정의 됩니다. E3 리가 스모 활용16, 절대적으로 필요 하지 않습니다 하지만 기판 및 스모 paralogue 특이성을 제공 합니다. 일반적으로 이후 총 기질 단백질의 작은 분수는 스모 수정 SUMOylated 단백질에서 vivo에서 의 탐지 항상 도전 이다. 따라서, 정확 하 고 재현성 분석 스모 수정의 정확한 기능을 명료 하 게 하기 위해 필요 합니다.
생체 외에서 SUMOylation 분석 결과, 기질 단백질의 SUMOylation 촉매 정화 Ubc9의 능력을 평가 하는 스모 수정17공부에 대 한 분석 결과 잘 허용된. 그러나, 대부분의 경우에서 스모 E3 리가 활동 감지 되지 않을 수 또는 검출 될 수 있다 돌연변이 스모 리가와 높은 스모 E3 리가 활동 및 낮은 기질 특이성 표준 프로토콜에 의해 Ubc918 의 풍부한 금액의 존재 때문에 . 순화 Ubc9의 주의 적정이이 분석 결과의 전반적인 성공에 의하여 크게 달려 있다. 생체 외에서 SUMOylation 분석 결과 여기에 설명 된 표준 SUMOylation에서 수정할 프로토콜 ( 재료의 표참조). Kaposi의 육 종 관련 herpesvirus (KSHV) 다시 활성화 하는 동안 증가 글로벌 스모 수정 관찰 SUMOylation의 업 레 귤 레이 션에 대 한 책임이 있을 수 있습니다 바이러스 성 스모 E3 리가 식별 하 라는 메시지가. 다음 바이러스 스모 E3 리가 K bZIP의 상호 작용 단백질의 소규모 상영, p53 소설 기판으로 확인 되었습니다. 이 프로토콜에서 우리 곤충 세포는 표현과 스모-2/3으로 바이러스 스모 E3 리가 K bZIP 야생-타입의 정화에 단계가 자세히 보여줍니다. E1 및 E2 효소의 감소 금액의 p53, 유명한 스모 기판의 SUMOylation를 향상 시키기 위해 정화 K bZIP의 능력 평가 됩니다. 이 수정된 SUMOylation 분석 결과 사용 하 여, 연구원은 안정적으로 정의할 수 스모 E3 리가의 능력 SUMOylate 소설 또는 알려진된 기판 단백질 SUMOylation의 연구에 기본 단계입니다. 또한,이 방법은 낮은 리가 활동 하지만 높은 기질 특이성 소설 스모 E3 ligases를 확인할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
생체 외에서 SUMOylation 프로토콜 여기에 설명 된 확인 된 Ubc9 기판의 SUMOylation 상태 설정 정기적으로 사용 됩니다. 스모 E3 리가의 SUMOylation 함수를 공부 하는 표준 프로토콜을 사용 하 여 주요 한계는 스모 E1 활성화 및 E2 변화 효소 Ubc9 체 외에 시스템에서 스모 활용을 극대화 하는 풍부한. 이 문제를 고려 하면 우리가 믿는 그 적정 수준에 스모 E1 및 E2 효소의 양을 하나 겨우 SUMOylation에 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에서 과학과 기술 (PCC에 대부분, 105-2320-B-010-007-MY3), 국립 보건 연구소 (NHRI-EX105-10215BC PCC에)에서 과학과 기술 (가장 105-2314-B-400-019에서 교부 금에 의해 지원 되었다 HJK)을 국립 보건 연구소 (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 HJK)에서. 이 작품 또한 PCC 원고 게시에 국립 양 밍 대학으로 부분적으로 지원 되었다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정, 게시 또는 원고의 배상에 아무 역할을 했다.
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
Riferimenti
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