In Vitro Ensaio de SUMOylation para estudar a atividade de Ligase E3 sumô
Summary
Ao contrário da ubiquitina ligases, foram identificados alguns ligases E3 sumô. Este modificado em vitro protocolo SUMOylation é capaz de identificar o romance sumô E3 ligases por um ensaio de reconstituição em vitro .
Abstract
Modificação de pequenos ubiquitin-como modificador (SUMO) é uma importante modificação pós-traducional (PTM) que medeia a transdução de sinal, principalmente através de interações da proteína-proteína de modulação. Semelhante à modificação da ubiquitina, SUMOylation é dirigido por uma cascata de enzima sequencial incluindo enzima E1-ativando (SAE1/SAE2), enzima E2-conjugação (Ubc9) e E3-ligase (i.e., família de PIAS, RanBP2 e Pc2). No entanto, diferente da ubiquitination, uma ligase E3 é não-essenciais para a reação, mas não fornecem precisão e eficácia para conjugação de sumô. Modificado por SUMOylation de proteínas podem ser identificadas por ensaio na vivo através da imunoprecipitação com anticorpos específicos do substrato e immunoblotting com anticorpos específicos de sumô. No entanto, a demonstração da atividade de ligase E3 sumô proteína requer em vitro reconstituição dos ensaios SUMOylation usando enzimas purificadas, substrato e proteínas de sumô. Desde que nas reações em vitro , geralmente SAE1/SAE2 e Ubc9, só são suficientes para conjugação de sumô, realce de SUMOylation por um putativo ligase E3 nem sempre é fácil de detectar. Aqui, descrevemos um modificado em vitro protocolo de SUMOylation que identifica consistentemente a modificação de sumô usando um sistema em vitro reconstituído. Um protocolo passo a passo para purificar cataliticamente ativo K-bZIP, um viral ligase E3 de sumô-2/3, também é apresentado. As atividades de SUMOylation da K-bZIP purificada são mostradas na p53, um destino bem conhecido do sumô. Este protocolo pode não apenas ser empregado para elucidar o romance sumô E3 ligases, mas também por revelar a sua especificidade de paralog de sumô.
Introduction
Modificação de sumô foi inicialmente identificada como uma modificação pós-traducional reversível (PTM) que regula a proteína estabilidade1. Além de conjugação direta, sumô também pode ser anexado a uma proteína através de interação não-covalente de sumô interação motivos (SIMs)2. Semelhante a vinculação de correntes-fosforilação por moléculas abrigando Src homologia 2 (SH2) ou ligação phosphotyrosine (PTB) domínios3,4, modificação de sumô fornece uma plataforma de interação adicional para seletiva recrutamento de SIM-contendo effector proteínas5,6. Além do Regulamento de transdução de sinal, SUMOylation de fatores transcricionais e cromatina remodelação moléculas servem para modular a expressão de gene7,8. Estudos dos padrões de SUMOylation de todo o genoma revelaram que a modificação de sumô está associada com positivo9,10 ou negativo10,11,12 transcrição Regulamento, em parte devido à especificidade de paralogue de SUMOylation.
Existem três principais isoformas de sumô para proteína, conjugando presente em células de mamíferos; Estes incluem SUMO-1 e altamente homólogos sumô-2 e 3-sumô (referido como SUMO-2/3)13. SUMÔ é normalmente conjugado com o resíduo de lisina (K) dentro do motivo de ψKxD/E consenso na proteína alvo. O cartão SIM no sumô E3 ligases é responsável para a especificidade de paralogue14. Em contraste com os caminhos da ubiquitination contendo centenas de E3 ligases, somente há alguns sumô E3 ligases identificados15. Ligases E3 de sumô são definidos pelas propriedades, incluindo a sua capacidade de (i) ligar Ubc9, (ii) ligar moiety sumô via um domínio SIM e (iii) melhorar a transferência SUMO de Ubc9 em carcaça. Ligase E3 não é absolutamente necessário para sumô conjugação16, mas fornece o substrato e a especificidade de sumô-paralogue. Desde geralmente apenas uma pequena fração da proteína total do substrato é sumô-modificado, detecção de SUMOylated proteínas na vivo é sempre um desafio. Portanto, ensaios precisos e reprodutíveis são necessárias a fim de elucidar a função precisa de modificação de sumô.
O em vitro ensaio de SUMOylation, que avalia a capacidade de Ubc9 purificado para catalisar SUMOylation das proteínas do substrato, é um ensaio bem aceitado para o estudo de modificação de sumô17. No entanto, a atividade de ligase E3 de sumô na maioria dos casos não pode ser detectada ou só pode ser detectada com mutantes ligase do sumô com alta atividade de ligase E3 de sumô e baixa especificidade pelo protocolo padrão devido à presença de uma quantidade abundante de Ubc918 . O sucesso deste teste depende em grande parte à titulação cuidadosa de Ubc9 purificado. O ensaio SUMOylation em vitro descrito aqui é modificado de uma SUMOylation padrão protocolo (consulte Tabela de materiais). A observação de aumento global modificação de sumô durante a reativação de herpesvírus associado sarcoma de Kaposi (KSHV) levou-na identificar o ligase E3 sumô viral que pode ser responsável para a regulação da SUMOylation. Após uma triagem em pequena escala das proteínas de interação de viral sumô E3 ligase do K-bZIP, p53 foi identificado como um substrato de romance. Neste protocolo, mostramos detalhadamente em células de inseto as etapas envolvidas na expressão e purificação do selvagem-tipo K-bZIP, uma ligase E3 sumô viral com especificidade de sumô-2/3. A capacidade do K-bZIP purificado de aumentar SUMOylation de p53, um substrato de sumô bem conhecido, é avaliada na presença de quantidades reduzidas de enzimas E1 e E2. Usando este ensaio SUMOylation modificado, investigadores podem confiantemente definir as habilidades de sumô E3 ligase do SUMOylate romance ou substratos conhecidos, que é uma etapa preliminar no estudo da proteína SUMOylation. Além disso, esse método ajuda a identificar romance sumô E3 ligases com ligase baixa atividade, mas alta especificidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
O em vitro SUMOylation protocolo descrito aqui é rotineiramente utilizado para estabelecer o status SUMOylation de substratos de Ubc9 identificados. A limitação principal usando o protocolo padrão para estudar a função de SUMOylation de sumô E3 ligase é a abundância de ativação de sumô E1 e E2 conjugação enzimas Ubc9 que maximizam a conjugação de sumô em sistemas em vitro . Considerando esse desafio, nós acreditamos que essa titulação da quantidade de enzimas sumô E1 e E2 para o ní…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por doações do Ministério da ciência e tecnologia (a maioria, 105-2320-B-010-007-MY3 a PCC), do Instituto Nacional de pesquisa de saúde (INDH-EX105-10215BC, a PCC), do Ministério da ciência e tecnologia (mais 105-2314-B-400-019 para HJK) e do Instituto Nacional de pesquisas saúde (INDH MG-105-SP-10, INDH MG-106-SP-10 para HJK). Este trabalho também foi financiado em parte com a Universidade Nacional de Yang-Ming na publicação do manuscrito para o PCC. Os financiadores não tinham qualquer papel no projeto de estudo, coleta de dados e análise, a decisão de publicar ou reparação do manuscrito.
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
Riferimenti
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