In Vitro SUMOylation Assay att studera SUMO E3 Ligase aktivitet
Summary
Till skillnad från ubiquitin ligases, har några E3 SUMO ligases identifierats. Denna modifierade in vitro- SUMOylation protokoll är kunna identifiera nya SUMO E3 ligases genom beredning in vitro- test.
Abstract
Liten ubiquitin-liknande modifierare (SUMO) ändring är en viktig post-translationella ändring (PTM) som medierar cellsignalering främst genom modulerande protein-protein interaktioner. Liknar ubiquitin modifiering, SUMOylation är regisserad av en sekventiell enzym kaskad inklusive E1-aktiverande enzym (SAE1/SAE2), E2-konjugation enzym (Ubc9) och E3-ligase (dvs, PIAS familj, RanBP2 och Pc2). Dock skiljer sig från ubikvitinering, en E3-ligase är icke-väsentliga för reaktionen men inte ger precision och effekt för SUMO konjugation. Proteiner modifieras av SUMOylation kan identifieras genom in-vivo analys via immunoprecipitation med substrat-specifika antikroppar och immunoblotting med SUMO-specifika antikroppar. Demonstration av protein SUMO E3 ligase aktivitet kräver dock in vitro- beredning av SUMOylation analyser med renade enzymer, substrat och SUMO proteiner. Eftersom i in vitro- reaktioner, oftast SAE1/SAE2 och Ubc9, ensam är tillräcklig för SUMO konjugation, är förbättring av SUMOylation av en förmodad E3-ligase inte alltid lätt att upptäcka. Här beskriver vi en modifierad in vitro- SUMOylation protokoll som konsekvent identifierar SUMO ändring med hjälp av ett in vitro- beredning-system. En steg för steg-protokollet att rena katalytiskt aktiva K-bZIP, en viral SUMO-2/3 E3-ligase, presenteras också. SUMOylation verksamhet den renade K-bZIP visas på p53, ett välkänt mål för SUMO. Detta protokoll kan inte bara användas för att belysa nya SUMO E3 ligases, men också för att avslöja deras SUMO paralog specificitet.
Introduction
SUMO modifiering identifierades inledningsvis som en reversibel posttranslationella modifieringen (PTM) som reglerar protein stabilitet1. Förutom direkta konjugation, kan SUMO också bifogas ett protein genom icke-kovalenta interaktion av SUMO interaktion motiv (SIMs)2. Liknar den bindningen av tyrosyl-fosforylering av molekyler som härbärgerat Src homologi 2 (SH2) eller phosphotyrosine bindande (PTB) domäner3,4, SUMO modifiering ger en ytterligare interaktion plattform för selektiv rekrytering av SIM-innehållande effektor proteiner5,6. Förutom regleringen av signaltransduktion fungerar SUMOylation av transkriptionell faktorer och kromatin remodeling molekyler att modulera gen uttryck7,8. Studier av genome-wide SUMOylation mönster har visat att SUMO modifiering är associerade med antingen positiva9,10 eller negativa10,11,12 transkription förordning, delvis på grund av SUMOylation paralogue specificitet.
Det finns tre stora SUMO isoformer för protein konjugera närvarande i däggdjursceller; Dessa inkluderar SUMO-1, och mycket homologa SUMO-2 och SUMO-3 (kallad SUMO-2/3)13. SUMO är vanligtvis konjugerat till lysin (K) återstoden inom ψKxD/E samförstånd motivet i målproteinet. SIM-kortet i SUMO E3 ligases ansvarar för paralogue specificitet14. I motsats till ubikvitinering vägar som innehåller hundratals E3 ligases, har det bara varit några SUMO E3 ligases identifierade15. SUMO E3 ligases definieras av fastigheter, inklusive deras förmåga att (i) binda Ubc9, (ii) binder SUMO biexponentiellt via en SIM-domän och (iii) förbättra SUMO överföring från Ubc9 på substrat. E3 ligase är inte absolut nödvändigt för SUMO konjugation16, men ger substrat och SUMO-paralogue specificitet. Sedan oftast endast en bråkdel av det totala underlag proteinet är SUMO-modifierat, är detektion av SUMOylated proteiner i vivo alltid en utmaning. Därför behövs exakt och reproducerbar analyser för att klarlägga den exakta funktionen av SUMO modifiering.
I in vitro- SUMOylation-test, som utvärderar renat Ubc9 förmåga att katalysera SUMOylation av substrat proteiner, är en väl accepterade analys för att studera SUMO ändring17. Dock SUMO E3 ligase aktivitet i de flesta fall inte kan upptäckas eller kan endast upptäckas med muterade SUMO ligase med hög SUMO E3 ligase aktivitet och låg substrat specificitet av standardprotokollet på grund av närvaron av en riklig mängd Ubc918 . Den totala framgången för denna analys är till stor del beroende av noggrann titrering av renat Ubc9. In vitro- SUMOylation analysen beskrivs här ändras från en standard SUMOylation protokoll (se Tabell för material). Observation av ökad global SUMO ändring under Kaposis sarkom-associerade herpesvirus (KSHV) reaktivering föranlett oss att identifiera de virala SUMO E3-ligase som kan ansvara för Uppregleringen av SUMOylation. Efter en småskalig genomgång av de samverkande proteinerna av viral SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 identifierades som romanen substrat. I detta protokoll visar vi i detalj i insekt celler stegen inblandade i uttryck och rening av vild typ K-bZIP, en viral SUMO E3-ligase med SUMO-2/3 specificitet. Den renade K-bZIP förmåga att förbättra SUMOylation av p53, en välkänd SUMO substrat, utvärderas i närvaro av reducerade mängder E1 och E2 enzymer. Med denna modifierade SUMOylation analys, kan forskare tillförlitligt definiera kapaciteterna av SUMO E3 ligase SUMOylate roman eller kända substrat, vilket är en primär steg i studien av protein SUMOylation. Denna metod hjälper dessutom identifiera nya SUMO E3 ligases med låg ligase aktivitet men hög substrat specificitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I in vitro- SUMOylation-protokollet som beskrivs här används rutinmässigt att etablera SUMOylation status identifierade Ubc9 substrat. Den största begränsningen använda standardprotokollet för att studera funktionen SUMOylation av SUMO E3 ligase är överflödet av aktivering av SUMO E1 och E2 konjugera enzymer Ubc9 som maximerar SUMO konjugationen i in vitro- system. Med tanke på denna utmaning tror vi att titrering av SUMO E1 och E2 enzymer till nivån att man knappt kan upptäcka sin verksamh…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag från ministeriet för vetenskap och teknik (mest, 105-2320-B-010-007-MY3 till PCC), från den nationella Health Research Institute (NHRI-EX105-10215BC till PCC), från ministeriet för vetenskap och teknik (mest 105-2314-B-400-019 till HJK) och från the National Health Research Institute (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 till HJK). Detta arbete stöddes också delvis med National Yang-Ming University på manuskriptet publikationen till PCC. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller reparation av manuskriptet.
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
Riferimenti
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII–a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
