Method Article

Isolamento e coltura dei progenitori neurali seguito da immunoprecipitazione della cromatina di istone 3 lisina 79 Dimethylation Mark

DOI:

10.3791/56631

⸱

January 26th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Anatomy and Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un metodo efficace e riproducibile per isolare e coltura di cellule progenitrici neurali dal tessuto di cervello embrionale e postnatale per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di istone 3 lisina 79 dimethylation (H3K79me2) - un contrassegno dell'istone si trova all'interno del dominio globulare dell'istone 3.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo sviluppo del cervello è un processo complesso, che è controllato in maniera temporo-spaziale dai gradienti di morfogeni e diversi programmi trascrizionali. Inoltre, modificazioni epigenetiche della cromatina, come metilazione dell'istone, hanno un ruolo importante per stabilire e mantenere destini cellulari specifici all'interno di questo processo. La stragrande maggioranza di metilazione dell'istone si verifica sulla coda dell'istone flessibile, che è accessibile ai modificatori dell'istone, gomme e proteine istoniche lettore. Al contrario, H3K79 metilazione si trova nel dominio globulare dell'istone 3 ed è implicata in diverse funzioni evolutive. H3K79 metilazione è evolutivamente conservata e può essere trovata in una vasta gamma di specie da Homo sapiens di Saccharomyces cerevisiae. La modifica avviene in popolazioni differenti delle cellule all'interno di organismi, comprese le cellule progenitrici neurali. La posizione di metilazione di H3K79 nel dominio globulare dell'istone 3 lo rende difficile da valutare. Qui, presentiamo metodi per isolare e progenitrici corticale cultura cellule (CPCs) dal tessuto cerebrale corticale embrionale (E11.5-e. 14.5) o progenitori del neurone granulare cerebellare (CGNPs) dal tessuto postnatale (P5-P7) e in modo efficiente immunoprecipitate H3K79me2 per PCR quantitativa (qPCR) e sequenziamento del genoma.

Introduction

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Le funzioni sensoriali, motorie e cognitive del cervello sono estremamente complessi e sensibili ai cambiamenti fisici ed ambientali. Il cervello è costituito da tre parti generali hind-, mid-e del forebrain, che sono profondamente collegati. All'interno del forebrain, telencefalo può essere diviso in un telencefalo dorsale (DT) e un ventrale telencefalo (VT). Il DT dei topi è costituito da sei strati corticali che si formano tra E11.5 ed E18.5 in un modo "inside-out"1. Il VT comprende le eminenze gangliare in sviluppo, che poi formano i gangli basali2,3. Diversi tipi di cellule possono....

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Protocol

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Comitati di benessere degli animali delle autorità locali e Università di Friburgo ha approvato tutti gli esperimenti sugli animali (G12/13, G16/11) menzionati nel protocollo seguente.

1. preparati

  1. Preparazioni per l'isolamento del CPCs
    1. Impostare tempo accoppiamento per ottenere embrioni a diversi stadi di sviluppo della corteccia (tra E11.5 ed e 14.5). Utilizzare i topi del ceppo NMRI (Naval Medical Research Institute), che sono almeno 8 settimane di vita. Dopo l'accoppiamento, considera un plug vaginale positivo a 0.5.
    2. Per avere materiale sufficiente, è possibile utilizzare una cucciolata d....

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Results

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Schema generale di isolamento progenitrici neurali, coltivazione, metodi di analisi H3K79me2 ChIP e ChIP: La figura 1 Mostra un diagramma di flusso per eseguire H3K79me2 ChIP di cellule progenitrici corticale in diversi momenti durante lo sviluppo embrionale del cervello o dei progenitori del neurone granulare cerebellare nelle fasi post-natale. Come primo passo, il cervello deve essere isolato e il telencefalo (tra E11.5 ed e 14.5) o del cer.......

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Discussion

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Ci sono due modi principali per eseguire immunoprecipitazione della cromatina per rilevare l'occupazione genomica di modificazioni istoniche, fattori di trascrizione, i lettori di codice dell'istone, scrittori o gomme. Uno è il metodo di ChIP nativo usando nucleasi digerita, nativo della cromatina per immunoprecipitazione, e l'altro è il metodo presentato utilizzando la cromatina PFA-fisso, tranciata, in cui i nucleosomes e altre proteine DNA-collegato sono covalentemente al DNA 39. ChIP nativo co.......

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Disclosures

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari

Acknowledgements

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Ringraziamo Henriette Bertemes per aver contribuito a stabilire il protocollo di coltivazione CGN all'interno del laboratorio. Questa carta di metodo era sostenuta dall'epigenetica medica CRC992 DFG-finanziato dai finanziamenti alla TV. Gli autori riconoscono il supporto del Team Galassia Freiburg: Pavankumar Videm, Björn Grüning e Prof. ssa Rolf Backofen, bioinformatica, Università di Friburgo, in Germania, finanziato dal centro ricerca collaborativo 992 epigenetica medica (grant DFG SFB 992/1 2012) e Ministero federale tedesco dell'istruzione e della ricerca (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-GAPDHAbcamab8245Category: Antibody
Abbreviation/Commento: Diluizione dell'immunoblot 1:5000
Anti-H3Abcamab1791Category: Antibody
Abbreviation/Commento: Diluizione dell'immunoblot 1:3000
Anti-H3K79me2DiagenodepAb-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Commento: Anticorpo ChIP
Anti-H3K79me2Abcamab-051-050Category: Antibody
Abbreviation/Commento: Diluizione di immunoblot 1:1000
Anti-rabbit-IgGDiagenodeC15410206Category: Antibody
Abbreviation/Commento: ChIP Ctrl Antibody
Anti-Tubulin alphaAbcamab108629Category: Antibody
Abbreviation/Commento: Diluizione di Immunoblot 1:3000
Apo-Transferrin (1 mg/ml)Sigma-AldrichT1147Category: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: Per l'integratore CCM
B27 (50x)Life Technologies17504044Category: Cell Culture
Abbreviation/Commento: Per le tecnologie CCM
BioanalyzerAgilentG2940CACategory: ChIP
Abbreviation/Commento: Per l'analisi della cromatina tranciata
Bioruptor NextGenDiagenodeB01020001Category: ChIP
Abbreviation/Commento: Ultrasuonatore
Acido borico pH 8.4Sigma AldrichB6768Category: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: Per la coltura CPC
CFX Connect RT PCR Detection SystemBio-Rad1855201Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Commento: Sistema di rilevamento per qPCR
DMEM-F12Life Technologies11320-033Category: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: Per CGM
Dynabeads Protein AInvitrogen10001DCategory: ChIP
Abbreviation/Commento: Perline magnetiche, per ChIP
EPZ-5676SelleckchemS7062Category: Inibizione DOT1L
Abbreviation/Commento: Per l'inibizione di DOT1L in coltura cellulare
Acido etilendiammine tetraaceticoSERVA39760.01Category: ChIP
Abbreviation/Commento: EDTA
Siero fetale bovino 10% (v/v)Gibco10082147Category: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: Per l'isolamento CPC e CGM
GlucosioSigma-AldrichG5767Category: Cell Culture
Abbreviation/Commento: Per l'isolamento CGNP
Glutatione (1,25 mg/ml)Sigma-AldrichG4251Category: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: Per CCM
GlycineCarl Roth3187Category: ChIP
Abbreviation/Commento: Per la fissazione cellulare
GoTaq mastermixPromegaA6002Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Commento: Miscela master di DNA polimerasi per qPCR
Hank' s Soluzione salina bilanciataLife Technologies14025-100Category: Cell culture
Abbreviation/Commento: HBSS
L-glutammina (200 mM)Life Technologies25030081Category: Cell culture
Abbreviation/Commento: Per CCM
LamininSigma-AldrichL2020Category: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: Per la coltura di CPC
Cloruro di litioSigma-AldrichL4408Category: ChIP
Abbreviation/Commento: Integratore LiCl
N2Life Technologies17502048Category: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: Per CGM
NanoDrop 3300Thermo Fisher3300Category: ChIP
Abbreviation/Commento: Fluorospettrometro per la quantificazione del DNA
NEB Next Ultra Kit di preparazione della libreria DNA per IlluminaNEBE7645SCategory: ChIP Analysis
Abbreviation/Commento: Kit per la preparazione della libreria
NEBNext Multiplex Oligos for IlluminaNEBE7335Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Commento: Oligo per la preparazione della libreria
Medium neurobasaleGibco21103049Category: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: Per CCM
NP-40 AlternativeCalbiochem492016Category: ChIP
Abbreviation/Commento: Per tampone ChIP
ParaformaldeideCarl Roth335Category: ChIP
Abbreviation/Commento: PFA, per la fissazione cellulare
Penicillina-Streptomicina-Neomicina 1% (v/v)Life Technologies15640055Category: Cell culture
Abbreviation/Commento: PSN, per soluzione salina tamponata con fosfato CCM e CGM
Life Technologies10010023Category: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: PBS, per l'isolamento CPC
PicoGreen KitThermo FisherP11496Category: ChIP Analysis
Abbreviation/Commento: Colorante di visualizzazione per la quantificazione del DNA
Poli-D-lisinaSigma-AldrichP6407Category: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: Per l'isolamento CGNP
Bromidrato di poli-L-ornitinaSigmaAldrich P3655Category: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: Per la coltura di CPC
Cloruro di potassioThermo FisherAM9640GCategory: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: KCl, per
l'inibitore della proteasiRoche4693159001Category: ChIP
Abbreviation/Commento: Per la
proteinasiSigma-Aldrich3115879001Category: ChIP
Abbreviation/Commento: Per ChIP
Qiagen MinEluteQiagen28004Category: ChIP
Abbreviation/Commento: Kit per la purificazione del DNA
RNAseSigma-AldrichR6513Category: ChIP
Abbreviazione/Commento: Per ChIP
SGC0946SelleckchemS7079Category: Inibizione DOT1L
Abbreviazione/Commento: Per l'inibizione di DOT1L in coltura cellulare
Bicarbonato di sodioCarl Roth8551.1Category: ChIP
Abbreviazione/Commento: per tampone di eluizione
Cloruro di sodioCarl Roth9265Category: ChIP
Abbreviation/Commento: NaCl, per il tampone ChIP
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970Category: ChIP
Abbreviation/Commento: per ChIP
Sodium dodecilsolfatoCarl Roth183Category: ChIP
Abbreviation/Commento: SDS, for ChIP
Sonic hedgehock (SHH)Sigma-AldrichSRP6004Category: Cell culture
Abbreviation/Commento: Per l'isolamento CGNP
Superossido dismutasi (1mg/ml)Sigma-AldrichS7571Category: Coltura cellulare
Abbreviation/Commento: Per CCM
Tris(idrossimetil)aminometanoCarl Roth9090Category: ChIP
Abbreviation/Commento: TRIS, per tampone ChIP
Triton X-100Carl RothX100Category: ChIP
Abbreviation/Commento: Per il tampone ChIP
Trypsin-EDTA 0,05% (w/v)Sigma Aldrich59417CCategory: Cell culture
Abbreviation/Commento: Per l'isolamento CPC
Tween20Carl Roth28320Category: ChIP
Abbreviation/Commento: Per la preparazione di perline
Altri dispositivi da laboratorio: Camera di conteggio Neubauer, Incubatore, Rotatore, Agitatore, Set di dissezione, Bagno
CCM: Terreno
CGM: Terreno
CGM ChIP K d'acquacellulare corticale di coltura cellulare CGNP

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
  2. Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science....

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Neural ProgenitorsChromatin ImmunoprecipitationHistone 3 Lysine 79 DimethylationCerebellar Granular Neuron ProgenitorsCortical Progenitor CellsTissue DigestionCell CultureFlow CytometryWestern BlotqPCR Analysis

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