Luciferase Complementation Imaging analysen i Nicotiana benthamiana blader for Transiently bestemme Protein-protein samhandling Dynamics
Summary
Dette manuskriptet beskriver en enkel og rask eksperimentelle prosedyren for å bestemme protein-protein interaksjoner basert på måling av luciferase aktivitet.
Abstract
Protein-protein interaksjoner er grunnleggende mekanismer for videresending signaltransduksjon i mest cellulære prosesser; Identifikasjon av roman protein-protein samhandling par og overvåking protein samhandling dynamics er derfor av særlig interesse for å avsløre hvordan planter reagerer på miljømessige faktorer og/eller utviklingsmessige signaler. En mengde tilnærminger har blitt utviklet for å undersøke protein-protein interaksjoner, enten i vitro eller i vivo. Blant dem er den nylig etablerte luciferase complementation imaging (LCI) analysen den enkleste og raskeste metoden for å demonstrere i vivo protein-protein interaksjoner. I denne analysen, protein A eller protein B er smeltet sammen med den amino-terminal eller carboxyl-terminal delen av luciferase, henholdsvis. Når protein A samhandler med protein B, vil de to halvdelene av luciferase rekonstitueres for å danne en funksjonell og aktive luciferase enzym. Luciferase aktivitet kan registreres med en luminometer eller CCD-kameraet. Sammenlignet med andre tilnærminger, viser LCI analysen protein-protein interaksjoner både kvalitativt og kvantitativt. Agrobacterium infiltrasjon i Nicotiana benthamiana blader er en mye brukt system for forbigående protein uttrykk. Med en kombinasjon av LSI og forbigående uttrykk viser disse metodene at det fysiske samspillet mellom COP1 og SPA1 ble gradvis redusert etter jasmonate behandling.
Introduction
Samordne vekst med omgivelsene, planter utviklet seg elegante signalveier forstand, transduce og svare på signalnettverk signaler. Som løpere i et relé rase er proteiner nødvendig spillere i anlegget signaltransduksjon. Det har vært anerkjent at protein-protein interaksjon (PPT) spiller en viktig rolle for mobil kommunikasjon. Protein fosforylering, acetylation og fornedrelse er alle avhengige av fysiske samspillet mellom et mål protein og dens endring enzymer. For eksempel Jasmonate ZIM domener protein (JAZ) familie proteiner samhandle med transkripsjon faktor MYC2 og undertrykke sine transcriptional aktivitet1,2. Gitt viktigheten av PPT utforsket store protein interactomes i planter har vært nylig3,4,5. Disse interactome resultatene ytterligere avsløre komplekse regulatoriske nettverket som koordinerer mangfoldig cellulære funksjoner.
Er det noen etablerte metoder for overvåking PPI. Gjær to hybrid (Y2H) analysen er den mest brukte metoden for påvisning av PPT. Y2H er enkel å utføre, og egnet for en rask test for å undersøke protein interaksjoner. Y2H er også mye brukt for screening ukjent samhandling partnere for den bestemte protein-av-begrave. Men fordi Y2H er helt gjennomført i gjær, gjenspeiler ikke det den virkelige situasjonen i anlegget celler og gir høy falske positive priser. En annen lignende strategi er rullegardin analysen. Generelt, er to proteiner uttrykt renset fra Escherichia coli celler og blandet og immobilisert for å oppdage protein interaksjoner. Selv om denne metoden ikke er tidkrevende, det kan ikke hente i vivo samhandling resultatene enten. For i vivo samhandling formål er co-immunoprecipitation (co-IP) mest populære analysen, som krever høy kvalitet mot immunoprecipitate protein-av-begrave og kan ikke utelukke muligheten for indirekte PPIs. Videre, på grunn av kompliserte eksperimentelle prosedyrene i co-IP, resultatene vanligvis varierer med individuelle kompetanse.
Reporteren basert rekonstituering analyser forhånd høyeste gjenkjenning av i vivo PPI. Disse metodene omfatter fluorescens resonans energi overføring (bånd)6, resultatet av dette fluorescens complementation (BiFC)7og den firefly luciferase complementation imaging (LCI) analysen8. Selv om disse tre tilnærminger er bedre enn co-IP for å reflektere den direkte i vivo PPT, bånd og BiFC trenger bestemte mikroskop å oppdage fluorescens signaler og kan ikke lett kvantifisere samhandling intensiteten. Derimot utnytter LCI firefly luciferase, som vil lyse etter reagere med sin substrat luciferin. Enda viktigere, kan PPI intensitet bestemmes fra verdien for luciferase aktivitet. Dermed angir LCI ikke bare om to proteiner samhandle eller ikke, men gir også informasjon om interaksjon dynamikken på behandling. Selv om det er noen etablerte metoder for overvåking samhandling dynamics (basert på overflaten plasmon resonans eller thermo-stabilitet Skift)9,10, krever disse metodene ømfintlige instrumenter eller bestemte merking. LCI er derimot enklere å utføre og oppdage.
Prinsippet LCI er at amino-terminal og carboxyl-terminal halvdelene av luciferase (kalt N-Luc eller C-Luc, henholdsvis) var smeltet sammen med protein A og B, og disse to fusion proteiner ble samtidig uttrykt i anlegget celler. Hvis protein A samhandler med protein B, vil de to halvdelene av luciferase rekonstitueres for å være et aktivt luciferase enzym. Luciferase aktivitet kan oppdages med luminometer eller CCD-kameraet. Det er ikke nødvendig å få stabile transformants for LCI; forbigående uttrykket er nok til å ha et høykvalitets samhandling som resultat.
RING-type E3 ubiquitin ligase grunnleggende photomorphogenic 1 (COP1) samhandler med en myriade av transkripsjonsfaktorer og fremmer deres fornedrelse gjennom 26S proteasome11. Noen av disse COP1 målrettede transkripsjonsfaktorer er positiv regulatorer for photomorphogenesis. I mørket samhandler COP1 med suppressor av phytochrome A-105 1 (SPA1), som forbedrer COP1 E3 aktivitet8. Etter oppfatning av lys, vil fotoreseptorer oppheve COP1-SPA1-samhandling for å hemme COP1 aktivitet og deretter stabilisere COP1 underlag12,13,14. Dette eksemplet illustrerer biologiske betydningen av studere PPT og bestemme PPI dynamics.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her er enkel og reproduserbar for å studere i vivo protein-protein interaksjoner, og spesielt egnet for å oppdage protein samhandling dynamics under eksogene behandling. Det viktigste trinnet i denne analysen er N. benthamiana infiltrasjon. For å sikre infiltrasjon suksess, må planter være veldig sunt. En annen viktig faktor er da å sjekke luciferase aktivitet etter infiltrasjon. Det er ingen korrekt svar for spørsmålet. Forskere oppfordres til å overvåke luciferase aktiv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation av Jiangsu provinsen (BK20140919), den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (31470375), prioritet faglig Program utvikling av Jiangsu institusjoner for høyere utdanning og Qing Lan prosjektet.
Materials
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
Riferimenti
- Thines, B., et al. JAZ repressor proteins are targets of the SCF(COI1) complex during jasmonate signalling. Nature. 448, 661-665 (2007).
- Chini, A., et al. The JAZ family of repressors is the missing link in jasmonate signalling. Nature. 448, 666-671 (2007).
- Jones, A. M., et al. Border control–a membrane-linked interactome of Arabidopsis. Science. 344, 711-716 (2014).
- Arabidopsis Interactome Mapping Consortium. Evidence for network evolution in an Arabidopsis interactome map. Science. 333, 601-607 (2011).
- Yazaki, J., et al. Mapping transcription factor interactome networks using HaloTag protein arrays. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4238-4247 (2016).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Walter, M., et al. Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation. Plant J. 40, 428-438 (2004).
- Chen, H., et al. Firefly luciferase complementation imaging assay for protein-protein interactions in plants. Plant Physiol. 146, 368-376 (2008).
- Layton, C. J., Hellinga, H. W. Quantitation of protein-protein interactions by thermal stability shift analysis. Protein Sci. 20, 1439-1450 (2011).
- Schuck, P. Reliable determination of binding affinity and kinetics using surface plasmon resonance biosensors. Curr Opin Biotechnol. 8, 498-502 (1997).
- Huang, X., Ouyang, X., Deng, X. W. Beyond repression of photomorphogenesis: role switching of COP/DET/FUS in light signaling. Current opinion in plant biology. 21, 96-103 (2014).
- Liu, B., Zuo, Z., Liu, H., Liu, X., Lin, C. Arabidopsis cryptochrome 1 interacts with SPA1 to suppress COP1 activity in response to blue light. Genes Dev. 25, 1029-1034 (2011).
- Lian, H. L., et al. Blue-light-dependent interaction of cryptochrome 1 with SPA1 defines a dynamic signaling mechanism. Genes Dev. 25, 1023-1028 (2011).
- Zuo, Z., Liu, H., Liu, B., Liu, X., Lin, C. Blue light-dependent interaction of CRY2 with SPA1 regulates COP1 activity and floral initiation in Arabidopsis. Curr Biol. 21, 841-847 (2011).
