En roman In Vitro Live-imaging test av Astrocyten-medierad fagocytos med pH-indikator-konjugerad Synaptosomes
Summary
Detta protokoll presenterar ett in vitro- live-imaging fagocytos test för att mäta fagocytos kapacitet av astrocyter. Renat råtta astrocyter och mikroglia används tillsammans med pH-indikator-konjugerad synaptosomes. Denna metod kan upptäcka realtid omvälvning och nedbrytning kinetik och ger en lämplig screening plattform för att identifiera faktorer som modulerande Astrocyten fagocytos.
Abstract
Astrocyter är den stora Celltypen i hjärnan och direkt kontakta synapser och blodkärl. Trots mikrogliaceller har betraktat den stora immunceller och endast fagocyter i hjärnan, har nyligen genomförda studier visat att astrocyterna också delta i olika fagocytos processer, såsom utvecklingsmässiga synaps eliminering och clearance av beta-amyloid plack vid Alzheimers sjukdom (AD). Trots dessa fynd är effektiviteten i Astrocyten omvälvning och nedbrytning av deras mål oklart jämfört med mikroglia. Denna brist på information är mestadels på grund av en analyssystem där kineticsen av Astrocyten – och mikroglia-medierad fagocytos enkelt jämförbara. För att uppnå detta mål, har vi utvecklat en långsiktig live-imaging i vitro fagocytos analys för att utvärdera renat astrocyter och mikroglia fagocytos kapacitet. I denna analys är realtid detektering av omvälvning och nedbrytning möjligt med hjälp av pH-indikator-konjugerad synaptosomes, som avger ljus röd fluorescens i sura organeller, såsom lysosomer. Våra roman analys ger enkel och effektiv upptäckt av fagocytos genom live-imaging. Denna i vitro fagocytos analys kan dessutom användas som screening plattform för att identifiera kemikalier och föreningar som kan förbättra eller hämmar astrocyter fagocytos kapacitet. Synaptic beskärning fel och patogena protein ackumulering har visat sig orsaka psykiska störningar eller neurodegenerativa sjukdomar, kemikalier och föreningar som modulerar gliaceller fagocytos kapacitet bör vara till hjälp vid behandling av olika neurologiska störningar.
Introduction
Gliaceller, som hänvisar till icke-retbara celler i hjärnan, är den stora Celltypen i det centrala nervsystemet (CNS). Tidigare betraktades gliaceller som enbart stödjande celler som främst spelar passiva roller att upprätthålla neuronal överlevnad och basala synaptic egenskaper. Nya bevis har emellertid avslöjat att gliaceller spelar en mer aktiv roll i olika aspekter av neurobiologi, såsom att upprätthålla hjärnan homeostas, medla synaps bildas1,2,3 och synapsen eliminering4,5, och modulerande synaptisk plasticitet6,7. Glial celler i CNS är astrocyter, mikroglia och oligodendrocyter. Bland dessa celler, astrocyter och mikroglia har visat sig spela fagocytos roller genom omvärvande synapser4,5, apoptotiska celler8, neurala skräp9och patogena proteiner, såsom beta-amyloid plack10,11. I hjärnans utveckling eliminera astrocyter synapser i dorsala laterala geniculate kärnan (dLGN) genom MERTK – och MEGF10-beroende fagocytos4. På samma sätt eliminera mikroglia också C1q-belagda synapser under utvecklingsstadier genom den klassiska komplement cascade5. Intressant, har det föreslagits att defekter i synapsen beskärning kan vara en av initiativtagarna till flera neurologiska sjukdomar. Det har exempelvis visat att mutationer i komplement komponent 4 (C4), vilket ökar komplement-medierad synaps beskärning av mikroglia, är starkt förknippat med förekomsten av schizofreni i människor12. En nyligen papper har också visat att den klassiska komplementbanan är hyperactivated i de inledande stadierna av AD och inducerar tidig synaps förlust i denna sjukdom13.
Jämfört med mikroglia-medierad fagocytos, är huruvida Astrocyten-medierad fagocytos bidrar till initiering och progression av olika neurologiska sjukdomar mindre tydlig. En nyligen papper antyder dock att faktorer som ändrar frekvensen av normal synaps beskärning av astrocyter kan störa hjärnan homeostas och bidrar till AD känslighet och patologi14. Graden av synaps beskärning av astrocyter styrs kraftfullt av ApoE isomerer, med en skyddande allel för AD (ApoE2) starkt förbättra hastigheten och en risk-allel för AD (ApoE4) avsevärt sänka hastigheten. Transgena möss uttrycker ApoE4 ackumulerade dessutom mycket mer synaptic C1q än kontroll eller ApoE2 möss14. Dessa data tyder på att nedsatt Astrocyten-medierad fagocytos i början AD hjärna kan inducera ackumulering av senescent C1q-belagda synapser/synaptic skräp som aktiverar komplement-medierad mikrogliala fagocytos, körning synaptic degeneration . Astrocyter i ApoE4 bärare nedsatt fagocytos kapacitet kan också bidra till okontrollerad ansamling av beta-amyloid plack i AD-drabbade hjärnor.
Det har dessutom visat att gliaceller i åldern Drosophila hjärnan förlorar sin fagocytos kapacitet på grund av minskad översättning av Draper, en homolog av Megf10 som astrocyter använder för phagocytosing synapser. Återställa Draper nivåer räddade fagocytos kapacitet av gliaceller, som effektivt rensas skadade axonal skräp i år hjärnan i liknande utsträckning som i den unga hjärnan, som anger att åldrande-inducerad förändringar i fagocytos kapacitet astrocyter kan bidra till störningar av hjärnans homeostas15.
Baserat på dessa nya rön, kan modulerande astrocyter fagocytos kapacitet vara en attraktiv terapeutiska strategi att förebygga och behandla olika neurologiska sjukdomar. I detta avseende har förekommit flera försök att öka fagocytos kapacitet av astrocyter, exempelvis genom att inducera försurning av lysosomer med sura nanopartiklar16 och överuttryck transkriptionsfaktor EB (TFEB), vilket kan öka Lysosomen biogenes17. Trots dessa försök är det fortfarande oklart hur astrocyter och mikrogliaceller skiljer sig i deras fagocytos kinetik och huruvida vi bör öka eller minska sin fagocytos kapacitet i olika sjukdomar.
I detta papper presentera vi en roman in vitro- test för att påvisa fagocytos kapacitet av astrocyter i realtid. Uppgifterna visar olika kinetik av omvälvning och nedbrytning i astrocyter och mikroglia. Astrocyten denvillkorade medium (ACM), som innehåller utsöndrade faktorer från astrocyter, är avgörande för effektiv fagocytos av både astrocyter och mikroglia. Dessutom spelar Megf10, en fagocytos receptor i astrocyter och en homolog Ced-1 och Draper, avgörande roller i Astrocyten-medierad fagocytos8,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna artikel presenterar vi metoder för en långsiktig live-imaging i vitro fagocytos analys med hjälp av renat gliaceller och pH-indikator-konjugerad synaptosomes. Vi visar att jämfört med mikroglia, astrocyter besitter olika omvälvning och nedbrytning kapacitet under fagocytos av synaptosomes. Dessutom tyder våra data på att Astrocyten-utsöndras faktorer, som innehåller överbryggande molekyler såsom GAS6, proteiner och MEGE8, är avgörande för effektiv PS-beroende fagocytos av gliaceller i hjä…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Yeon-Joo Jung för hennes experimental stöd under synaptosome rening och Jungjoo Park för bilder av synaptosomes med PS exponering. Dessutom, tackar vi alla medlemmar i Chungs laboratorium för bra diskussion. Detta arbete stöds av National Research Foundation av Korea (NRF) bidrag finansieras av den koreanska regeringen (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 och NRF-2016R1C1B3006969) (W.-S. (C).
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
Riferimenti
- Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
- Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
- Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
- Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
- Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
- Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
- Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer’s disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
- Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
- Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
- Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
- Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
