Summary

Establecimiento de un pH extracelular ácido sistema de cultivo

Published: November 19, 2017
doi:

Summary

El microambiente tumoral ácida juega un papel crítico en la progresión tumoral. Para evaluar los efectos del pH extracelular ácido en las células de cáncer in vitro, hemos establecido sistemas de cultivo ácidos simples.

Abstract

Condiciones del microambiente tumoral, tales como hipoxia o nutrientes hambre, juegan un papel crítico en la progresión del cáncer y la malignidad. Sin embargo, el papel del pH extracelular ácido en la agresividad del tumor y su mecanismo subyacente no ha sido extensivamente estudiado en comparación con las condiciones de hambre hipóxico o nutrientes. Además, un método de cultivo bien definidas para imitar el microambiente tumoral extracelular ácido no se ha completamente divulgado.

Aquí presentamos un método de cultivo simple en vitro para mantener el pH extracelular ácido utilizando reducción bicarbonato y lactato aumento o concentración de HCl en el medio de cultivo. El pH del medio fue sostenido durante al menos 24 h y poco a poco disminuyó en 72 h después de cultivo de células de cáncer de páncreas 1 PANC y AsPC-1. Tres condiciones de distintos medios ácidos en este estudio muy upregulated genes pH-sensibles tales como MSMO1, INSIG1y IDI1 compararon con hipoxia o hambre de nutrientes. La regulación al alza de estos genes puede utilizarse como marcador de pH ácido. Estas técnicas sencillas son beneficiosas para dilucidar los mecanismos subyacentes de la malignidad del tumor en el microambiente tumoral ácidos. Por lo tanto, nuestro sistema de cultura extracelular pH ácido permite descubrimiento de respuestas celulares de pH ácido en las células cancerosas, pero también en células primarias, como las células tubulares renales, en relación con los otros ácidos trastornos incluyendo, cetoacidosis diabética, acidosis láctica, la acidosis tubular renal y acidosis respiratoria.

Introduction

El microambiente tumoral juega un papel crítico en la progresión del tumor y cáncer de la célula metabolismo1,2,3. Las células cancerosas a menudo se exponen a condiciones como hipoxia, la privación de nutrientes y pH extracelular ácido (pHe). Sin embargo, el papel de pHe en la progresión tumoral no ha aclarado tan extensivamente como en hambre hipoxia o nutrientes. El pHe en el tejido del tumor puede ser ácida, llegando a aproximadamente pH 6.84,5. El pH ácido se presenta de aeróbica y anaeróbica glicolítica excreción de protones (H+) y lactato por la proliferación del cáncer las células5,6.

Estudios recientes revelaron que histona ácida inducida por pHe desacetilación y oxidación del ácido graso exocitosis de lisosomas ácidas para la adaptación al ambiente ácido fuerte7,8,9,10. Sin embargo, los mecanismos a través de la cual acidificación extracelular afecta comportamiento de cáncer y la identidad de clave de los reguladores en el microambiente tumoral de pH ácido no han sido completamente determinados. Además, varios informes describen varios medios de pH ácido, usando claro concentraciones de bicarbonato, tampón Tris, tubos y HEPES o lactato y ácido clorhídrico, pero hay pocos informes para demostrar la estabilidad de la ajustada media ni integral comparación de varios medios de cultivo ácidos distintos7,8,9,10

Para aclarar los principales reguladores y cambios metabólicos en las células cancerosas en el contexto de acidificación extracelular, estableció un modelo de cultura simple en vitro para mantener un pHe ácido y examinó el papel de pHe en células de cáncer11. Usando este método, mantuvimos un ácido medio de cultivo con un pHe de 6,8 a 37 ° C debajo del 5% CO2, usando las concentraciones de bicarbonato menor en el medio de cultivo. pH 7.4 se utilizó como normal y medio de control. El pH del medio fue sostenido durante al menos 24 h y poco a poco disminuyó en 72 h en cultivo de células de cáncer de páncreas 1 PANC y AsPC-1. Porque glicólisis mejorada acelera la excreción de protones, pero también lactato7,8,9, también estableció un método de cultura mímico acidosis inducida de lactato por la adición de lactato en lugar de reducir la concentración de bicarbonato. Además, inducida por el ácido clorhídrico ácido pHe en el medio nos permite excluir la posibilidad de que las respuestas celulares a pH ácido medio de cultivo no son debido a una disminución de la concentración de bicarbonato. Por otra parte, utilizando distintos medios con un pH de 6.4 a 7.4 con concentración diferente de bicarbonato, podemos evaluar la extensión de efectos de pHe en respuestas celulares.

Protocol

1. preparación de medio de cultivo ácidos Preparación de control (pH 7.4) y de medio de cultivo de pH bajo (pH 6.8) Disolver 4,75 g de polvo DMEM sin L-glutamina en 500 mL de agua. Preparar 0,33 M NaHCO3 solución en una botella de presión-apretado.PRECAUCIÓN: Es importante utilizar una botella de presión apretado ya que NaHCO3 emite CO2 gas cuando se calienta y se descompone térmicamente. Autoclave el medio y la soluc…

Representative Results

Para determinar la concentración adecuada de bicarbonato, preparamos DMEM en el rango de 0 – 8 mM NaHCO3 (concentración final en el medio de cultivo) y tuvo éxito en la preparación de medios de cultivo con pH entre 6.4-7.4 (figura 1). Preparamos DMEM con 8 mM NaHCO3 (pH 7.4) como medio de control y 2 mM NaHCO3 (pH 6.8) como un medio con pH ácido, según un informe anterior indicando que el pH extracelular llegue a pH 6.8 …

Discussion

Aquí, describimos un sistema de cultivo simple pH ácido y su proceso de evaluación. La combinación de tres métodos de acidificación del medio, es decir, concentración de bicarbonato menor, adición de lactato y adición de HCl, nos permitió investigar el mecanismo de respuesta de pH fondo y comparar la respuesta celular a otro tumor microambiental condiciones como hipoxia o alimento del hambre.

La clave de este método es determinar las concentraciones apropiadas de ácido clo…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los miembros de la división de Ciencias de genoma y laboratorio para Biología de sistemas y medicina, RCAST, la Universidad de Tokio. Agradecemos especialmente al Dr. H. Aburatani, Dr. T. Kodama, (LSBM, RCAST, la Universidad de Tokio), Dr. K. Tomizuka, Dr. T. Yoshida y Dr. A.
Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) para discusiones útiles y apoyo. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones para joven científico (A) (26710005, T.O.), subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (26116711 y 16 H 01567, T.O.) y subvenciones para difíciles
Investigación exploratoria (16K 14605, T.O.) desde el Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología de Japón, la Fundación de ciencia de Takeda (T.O.), la Fundación de Kobayashi de investigación del cáncer (T.O.) y el proyecto de investigación del cáncer y Evolución terapéutica (P-crear) y la investigación práctica para el Control del cáncer innovadoras de Japón Agencia de investigación médica y desarrollo, AMED (T.O.).

Materials

Reagents
Dulbecco's Modified Eagle Medium“Nissui” 2 Nissui 05919
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher  10438
NaHCO3 Wako 191-01305
L-glutamine solution Thermo Fisher  25030-081
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution(Stabilized) Nacalai 09367-34
0.5g/l-Tripsin/0.53mmol/l-EDTA Solution, with Phenol Red Nacalai 32778-05
0.5%-Trypan Blue Stain Solution Nacalai 29853-34
Lactic acid solution Sigma-Aldrich 252476
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H9892
RNeasy Plus Mini Kit QIAGEN 74134
SuperScript IV First-Strand Synthesis System Thermo Fisher  18091
Power SYBR Green PCR Master Mix  Applied Biosystems  4368702 
Name Company Catalog Number Comments
Cell lines
PANC-1 ATCC CRL-1469
AsPC-1 ATCC CRL-1682
KMS-6 JCRB Cell Bank JCRB0432
TIG JCRB Cell Bank
MRC9 ATCC CCL-212
HUVEC ATCC CRL-1730
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer with Wi-Fi Thermo Fisher ND-ONE-W
QuantStudio 5 Real-Time PCR System Thermo Fisher CRL-1682

Riferimenti

  1. Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).
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  5. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).
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Citazione di questo articolo
Kondo, A., Osawa, T. Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System. J. Vis. Exp. (129), e56660, doi:10.3791/56660 (2017).

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