해로운 효과의 낮은 압력 플라즈마 살 균 새 균의 subtilis 포자를 사용 하 여 라이브 셀 현미경의 생존에 조사
Summary
이 프로토콜 추적에 의해 모니터링 활력 매개 변수 및 저압 플라즈마 처리 후 새 균의 subtilis 포자를 되살리는에서 DNA 복구 프로세스의 관련성을 평가 하는 데 필요한 중요 한 연속 단계를 보여 줍니다. 형광 표시 DNA 복구 시간 해결 confocal 현미경 검사 법 및 전자 현미경 검사를 통해 단백질.
Abstract
플라즈마 살 균 산업, 임상, 및 spaceflight 목적으로 기존의 살 균 방법에 유망한 대안 이다. 저압 플라즈마 (LPP) 방전 급속 한 미생물 비활성화 이어질 활성 종의 광범위 한 스펙트럼을 포함. 효율성과 LPP에 의해 살 균의 메커니즘 연구, 우리는 기존의 살 균 절차에 대 한 그들의 특별 한 저항 때문에 새 균의 subtilis 테스트 기체의 포자를 사용 합니다. 우리는 B. subtilis 포자 monolayers, 이중 유도 결합된 플라즈마 반응 기, 스캐닝 전자 현미경 (SEM)을 사용 하 여 포자 형태학의 특성에서에서 저압 플라즈마에 의해 살 균 과정의 생산을 설명 하 고는 발 아 및 라이브 셀 현미경으로 포자의 파생물의 분석. 플라즈마의 주요 대상 게놈 소재 (DNA) 이며 포자 부흥 시 플라즈마 유도 DNA 장애의 복구는 생물의 생존을 위해 중요 한. 여기, 우리는 포자의 발 아 능력을 연구 하 고 DNA의 역할 붙일 이라는 DNA 복구 단백질 (RecA) 시간 해결 공초점 형광 현미경 검사 법으로 추적 하 여 LPP와 치료 후 포자 발 아 및 파생물 복구 합니다. 치료 및 치료 포자 monolayers는 발 아에 대 한 활성화 개별 포자의 반응에 따라 시간이 지남에 거꾸로 confocal 라이브 셀 현미경으로 시각. 우리의 관측 공개 출 아 포자를 빨리 성장 하 고 일부 LPP 트리트먼트 120 s. RecA YFP (노란색 형광 단백질) 형광 몇 포자에만 감지 되 고 모두에 개발 되었다 후 최소에 도달의 기간에 따라 달라 집니다. LPP 취급 포자에 약간의 상승으로 빨리 성장 세포. 또한, 일부 식물 박테리아의 세포질에 있는 증가 보여주었다 LPP 취급 포자에서 파생 된 그리고 lyse 경향이. 개별 포자의 분석에 대 한 설명된 방법 포자 발 아 및 파생물의 다른 측면의 연구에 대 한 훌륭한 될 수 있습니다.
Introduction
우주 탐사의 주요 목표는 생명체와 다른 행성 몸과 우리의 태양계에 있는 달에 생체의 서명에 대 한 검색입니다. 미생물의 전송 또는 탐험의 중요 한 영역을 지구 근원의 생체 개발 및 생활 탐지 임무 화성과 유로 파1등 행성의 시체의 무결성을 영향을 미칠 특정 위험입니다. 여는 위원회의 공간 연구 (COSPAR) 1967 년에에서 설립, 행성 보호의 국제 지침 다른 행성, 그들의 위성, 소행성, 및 다른 천체를 유인 하 고 로봇 임무에 대 한 엄격한 규제를 부과 하 고 규제는 청소 및 살 균 지상파 미생물 오염 제거 하 고 천체2의 교차 오염을 방지 하기 위하여 발사 하는 우주선과 이전 중요 한 하드웨어 구성 요소. 지난 10 년간 비 열 플라즈마의 응용 spaceflight 응용 프로그램3,,45뿐만 아니라 생물 의학 및 영양 연구에 광범위 한 관심을 얻고 있다. 신속 하 고 효율적인 미생물 비활성화6을 민감한 부드러운 고 열 불안정 물질 동안 제공 플라즈마 살 균은 기존의 살 균 방법에 유망한 대안 이다. 플라즈마 방전 자유 래 디 칼, 입자, 중립/흥분 원자, 광자 자외선 (UV), 진공 자외선 (VUV) 스펙트럼에 있는 급속 한 미생물 비활성화3반응 요원의 혼합물을 포함 합니다. 이 연구에서 우리는 새 균의 subtilis endospores 유리 테스트 표면에 배포를 비활성화 하 이중 저압 유도 결합된 플라즈마 (DICP) 소스7,8 에 의해 생성 된 저압 플라즈마를 사용 합니다.
가족 Bacillaceae 의 그람 양성 박테리아는 토양, 퇴적 물, 및 클린 룸 시설 등 국제 우주 정거장9,10 비정상적인 환경에서 뿐만 아니라 공기의 자연 서식 지에 널리 배포 ,11. 속 균 의 가장 뚜렷한 특징은 영양소 고갈12등 불리 한 조건, 살아남기 위해 저항력 휴면 endospores (포자 라 함)을 형성 하는 기능 이다. 포자는 일반적으로 훨씬 더 다양 한 트리 트 먼 트 및 환경 스트레스, 열, 자외선, 감마 방사선, 건조, 기계적 장애, 및 강한 산화 제와 같은 독성 화학 물질을 포함 하 여 식물 세포 들 보다 저항 또는 pH 변화 에이전트 (참조13,14에서 검토) 되며 따라서 미생물 비활성화 방법의 효율성을 테스트 하기 위한 이상적인 개체. 때문에 genomic DNA는 박테리아15,16, 병 변의 플라즈마 유도 DNA 수리의 플라즈마 처리의 주요 목표 (예: DNA 이중 가닥 나누기) 포자에 부흥은 박테리아13의 생존을 위해 중요 한 17.
따라서, 우리 연구 포자의 발 아 용량 및 DNA 복구의 역할 포자 발 아 및 파생물 다음 개별 포자에 의해 낮은 압력 아르곤 플라즈마와 포자를 치료 후 하 고 형광 표시 DNA의 그들의 표현을 수리합니다 시간이 해결 공초점 형광 현미경 검사 법으로 단백질 RecA. 우리는 재현할 수 있는 테스트 결과, 저압 플라즈마 살 균에 대 한 포자 monolayers의 처리, 플라즈마 처리 포자에 대 한 준비를 달성 하기 위한 monolayers에 B. subtilis 포자의 준비의 단계 지시를 주고 ultrastructural 평가 모니터링 활성 DNA와 함께에서 개별 포자의 수준에서 스캐닝 전자 현미경 (SEM), 그리고 라이브 셀 현미경 분석을 사용 하 여 셀 내에 플라즈마 처리에 발생 하는 프로세스를 복구 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
낮은 온도 사용 하 여 표면 살 균, 저압 플라즈마는 이온화 방사선, 화학 치료 등 오히려 기존의 살 균 절차를 유망한 대안 (예: 가스 H2O2 와 같은 또는 에틸렌 산화물) 또는 건조 하 고 습 한 열23. 일반 살 균 방법을 주로 효과적인 살 균을 제공 하지만 그들은 치료 재료 영향 및 연산자에 대 한 잠재적인 위험을 나타내는 알려져 있습니다. 저압 플라즈마는 자…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그녀의 도움을 비디오 촬영 하는 동안이 작업 및 Nikea J. 울 리 히의 부분 그녀의 우수한 기술 지원에 대 한 안드레아 슈뢰더를 감사합니다. 우리는 또한 새 균의 subtilis 긴장의 그의 관대 한 기부에 대 한 일 A. 시 몬스를 감사 하 고 싶습니다: LAS72 및 LAS24. 이 작품은 부분에서 교부 금에 의해에서 지원 독일 연구 재단 (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon 박 728) PA (AW 7/3-1) 고 RM (모 2023/2-1)와 DLR DLR-FuW-프로젝트 ISS 생활, 프로그램 RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, M.R. R.M.)를 부여 합니다. F.M.F. (6 년의 기간 동안 헬름홀츠 협회 (헬름홀츠 Gemeinschaft)에 의해 투자 되었다 쾰른, 독일, 독일 항공 우주 센터 (DLR)를에서 헬름홀츠 공간 생명 과학 연구 학교 (SpaceLife)의 박사 학위 장학금에 의해 지원 되었다 부여 번호 VH-KO-300) 항공 집행 위원회와 항공 우주 의학 연구소를 포함 하 여 DLR에서 추가 자금을 받았다. 이 연구의 결과 펠릭스 M. Fuchs의 박사 논문에 포함 될 것입니다.
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
Riferimenti
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