Enquête sur les néfastes effets de basse pression Plasma stérilisation sur la survie de Bacillus subtilis Spores en utilisant Live microscopie des cellules
Summary
Ce protocole illustre les étapes consécutives importantes nécessaires pour évaluer la pertinence de la surveillance des paramètres de vitalité et des processus de réparation de l’ADN dans la relance des spores de Bacillus subtilis après traitement par plasma basse pression par suivi réparation de l’ADN marquées fluorescence protéines par microscopie confocale résolue dans le temps et la microscopie électronique à balayage.
Abstract
Stérilisation de plasma est une alternative prometteuse aux méthodes de stérilisation conventionnelles fins industrielles, cliniques et de vols spatiaux habités. Décharges de plasma (LPP) basse pression contiennent un large éventail d’espèces actives, qui conduisent à une inactivation microbienne rapide. Afin d’étudier l’efficacité et les mécanismes de la stérilisation par la LPP, nous utilisons les spores de Bacillus subtilis l’organisme d’essai en raison de leur extraordinaire résistance contre les procédures de stérilisation conventionnelles. Les auteurs décrivent la production de b. subtilis monocouches de spore, le procédé de stérilisation par plasma à basse pression dans un réacteur à plasma à couplage inductif double, la caractérisation de la morphologie des spores à l’aide de la microscopie électronique à balayage (SEM) et le analyse de la germination et la croissance des spores par microscopie des cellules vivantes. Une cible majeure des espèces de plasma est matériel génomique (ADN) et la réparation des lésions de l’ADN induite par le plasma à la Renaissance de la spore est cruciale pour la survie de l’organisme. Ici, nous étudions la capacité de germination des spores et le rôle de l’ADN réparation au cours de la germination des spores et une excroissance après traitement avec PPR en pistant fluorescent marqué protéines réparation ADN (RecA) avec la microscopie en fluorescence confocal résolution temporelle. Traités et monocouches de spores non traitées sont activés pour la germination et visualisés avec un microscope confocal inversé de cellules vivantes dans le temps de suivre la réaction de spores individuelles. Nos observations montrent que la fraction de germination et de spores l’étroit dépend de la durée du LPP-traitement pour atteindre un minimum après que 120 s. RecA-YFP fluorescence (protéine de fluorescence jaune) a été détecté que chez quelques spores et développé dans tous les l’étroit des cellules avec une légère élévation dans les spores imprégnées sur la LPP. En outre, certaines des bactéries végétatives provenant de spores LPP-traités ont montré une augmentation de cytoplasme et tendaient à lyser. Les méthodes décrites pour l’analyse des spores individuelles pourraient être exemplaires pour l’étude d’autres aspects de la germination des spores et la croissance.
Introduction
Des principaux objectifs de l’exploration spatiale sont la recherche de signatures de formes de vie et de biomolécules sur d’autres corps planétaires et lunes de notre système solaire. Le transfert des micro-organismes ou des biomolécules d’origine terrestre à des domaines critiques d’exploration est présentant un risque particulier d’influencer le développement et l’intégrité des missions vie-détection sur les corps planétaires tels que Mars et Europe1. Les directives internationales de protection planétaire, mis en place par le Comité de la recherche spatiale (COSPAR) en 1967, imposer des règlements stricts sur les missions habitées et robotisées d’autres planètes, leurs satellites, astéroïdes et autres corps célestes et de réglementer les nettoyage et la stérilisation d’un véhicule spatial et composants matériel critique avant de lancer afin d’éliminer la contamination de micro-organismes terrestres et éviter toute contamination croisée des corps célestes,2. Durant la dernière décennie, l’application des plasmas non thermiques a gagné l’attention dans la recherche biomédicale et nutritionnelle, ainsi que dans le vol spatial applications3,4,5. Stérilisation de plasma est une alternative prometteuse aux méthodes de stérilisation classique car il offre6d’inactivation microbienne rapide et efficace, tout en étant douce à sensible et matériaux labile de la chaleur. Décharges de plasma contiennent un mélange d’agents réactifs tels que les photons dans l’ultraviolet (UV) et du spectre ultraviolet sous vide (VUV) qui conduisent à une inactivation microbienne rapide3, neutre/excités des atomes, particules chargées, radicaux libres. Dans cette étude, nous utilisons plasma basse pression généré par double torche à plasma basse pression (RCID) source7,8 pour inactiver les endospores Bacillus subtilis distribués sur le revêtement de verre.
Bactéries Gram-positives de la famille des Bacillaceae sont largement distribués dans les habitats naturels du sol, des sédiments et aériens ainsi que dans des environnements inhabituels tels que les salles blanches et de la Station spatiale internationale9,10 ,11. La caractéristique plus particulière du genre Bacillus est la capacité à former des endospores dormants très résistants (ci-après dénommés “spores”) pour survivre à des conditions défavorables, telles que l’épuisement des nutriments,12. Les spores sont généralement beaucoup plus résistants que leurs homologues de la cellule végétative d’une variété de traitements et des contraintes environnementales, y compris la chaleur, UV, irradiation gamma, dessiccation, rupture mécanique et produits chimiques toxiques, tels que les oxydants ou des agents de changement de pH (révisés dans les références13,,14) et sont donc des objets idéales pour tester l’efficacité des méthodes d’inactivation microbienne. Puisque l’ADN génomique est un objectif majeur du traitement plasma des bactéries15,16, la réparation des lésions de l’ADN induite par le plasma (comme les ruptures double brin d’ADN) sur spore revival est crucial pour la survie de bactéries13, 17.
Ainsi, nous étudions la capacité de germination des spores et le rôle de réparation de l’ADN au cours de la germination des spores et une excroissance après avoir traité les spores avec plasma d’argon basse pression par des spores individuels suivants et réparer leur expression d’ADN marqués par fluorescence protéine RecA avec la microscopie en fluorescence confocal résolution temporelle. Nous donnons une instruction étape par étape de la préparation des spores de b. subtilis en monocouches pour parvenir à des résultats de test reproductible, le traitement des monocouches de spore avec plasma basse pression pour la stérilisation, la préparation des spores du plasma traité pour ultrastructurale évaluation au moyen de la microscopie électronique à balayage (SEM) et l’analyse de microscopie de cellules vivantes au niveau des spores individuelles de concert avec l’ADN actif de surveillance processus survenant dans la cellule en réponse à un traitement plasma de réparation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stérilisation des surfaces à l’aide de basse température, plasma basse pression est une alternative prometteuse aux procédures de stérilisation plutôt classiques tels que le traitement par rayonnements ionisants, produits chimiques (p. ex. gaz comme H2O2 ou l’oxyde d’éthylène) ou23de la chaleur sèche et humide. Les méthodes de stérilisation ordinaires fournissent principalement une stérilisation efficace, mais ils sont connus pour influencer la mati…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Andrea Schröder pour son aide technique excellente pendant certaines parties de ce travail et Ulrich J. Nikea pour son aide pendant le tournage vidéo. Nous tenons également à remercier Lyle A. Simmons pour son don généreux des souches de Bacillus subtilis : LAS72 et LAS24. Ce travail a été soutenu en pièces grâce à des subventions de la Fondation allemande de la recherche (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) pour PA (AW-7/3-1) et RM (2023 MO/2-1) et le DLR accordent le DLR-ICMSA-Projekt ISS vie, Programm RF-ICMSA, 475 Teilprogramm (pour F.M.F, M.R. et R.M.). F.M.F. a été soutenue par une bourse de doctorat de l’école de recherche Helmholtz espace Sciences de la vie (SpaceLife) dans le centre aérospatial allemand (DLR) à Cologne, en Allemagne, qui a été financé par l’Association Helmholtz (Helmholtz-Gemeinschaft) sur une période de six ans ( Grant no VH-Ko-300) et reçu des fonds supplémentaires de la DLR, y compris le Conseil d’administration aérospatiale et de l’Institut de médecine aérospatiale. Les résultats de cette étude doivent figurer dans la thèse de doctorat de Felix M. Fuchs.
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
Riferimenti
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR’s Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma – A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907 (2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D. Ecology of Bacillaceae. Microbiol Spectr. 3, (2015).
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W., Sneath, P. A. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2, 1105-1141 (1986).
- Setlow, P. Spore Resistance Properties. Microbiol Spectr. 2, (2014).
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P. Catabolic repression of bacterial sporulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 54, 704-711 (1965).
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v. The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826 (2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972 (2013).
