Untersucht die nachteiligen Effekte der Low Druck Plasmasterilisation auf das Überleben von Bacillus Subtilis Sporen mittels Live Cell Mikroskopie
Summary
Dieses Protokoll zeigt die wichtigen aufeinander folgenden Schritte erforderlich, um die Relevanz der Überwachung Vitalität Parameter und DNA-Reparaturprozesse in Bacillus Subtilis Sporen nach der Behandlung mit Niederdruckplasma Wiederbelebung durch tracking Fluoreszenz-markierten DNA-Reparatur Proteine über zeitaufgelösten konfokalen Mikroskopie und Rasterelektronenmikroskopie.
Abstract
Plasmasterilisation ist eine vielversprechende Alternative zu herkömmlichen Sterilisationsverfahren für Industrie-, klinische, und Raumfahrt. Niederdruck-Plasma (LPP)-Entladungen enthalten ein breites Spektrum an aktiven Spezies, die zu schnellen mikrobiellen Inaktivierung führen. Um die Effizienz und die Mechanismen der Sterilisation durch BVG zu untersuchen, verwenden wir die Testorganismen Bacillus Subtilis Sporen wegen ihrer außerordentlichen Widerstand gegen konventionelle Sterilisationen. Wir beschreiben die Herstellung von B. Subtilis Sporen Monolagen, die Sterilisation durch Niederdruck-Plasma in einem Doppel Induktiv gekoppelte Plasma-Reaktor, die Charakterisierung der Spore Morphologie mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM), und die Analyse der Keimung und Auswuchs der Sporen durch live Zelle Mikroskopie. Ein wichtiges Ziel der Plasma-Arten ist genomic Materials (DNA) und Reparatur von Plasma-induzierten DNA-Läsionen bei Spore Wiederbelebung ist entscheidend für das Überleben des Organismus. Hier untersuchen wir die Keimfähigkeit der Sporen und die Rolle der DNA Reparatur während der Keimung der Spore und Auswuchs nach der Behandlung mit BVG durch die Verfolgung Eindringmittel gekennzeichnet DNA-Reparatur-Proteine (RecA) mit zeitaufgelösten konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Behandelte und unbehandelte Spore Monolagen sind aktiviert für die Keimung und visualisiert mit einem invertierten konfokale live Zelle Mikroskop im Laufe der Zeit, die Reaktion der einzelnen Sporen zu folgen. Unsere Beobachtungen zeigen, dass der Anteil der Keimen und Sporen entwachsen abhängig von der Dauer der LPP-Behandlung ein Minimum erreichen ist, nach 120 RecA-YFP s. (gelbe Fluoreszenz Protein) Fluoreszenz wurde nur in paar Sporen erkannt und entwickelt in allen Zellen mit eine leichte Erhöhung im BVG-behandelten Sporen entwachsen. Darüber hinaus einige der vegetativen Bakterien aus BVG-behandelten Sporen zeigten eine Zunahme im Zytoplasma und tendenziell aufzulösen. Die beschriebenen Methoden zur Analyse der einzelnen Sporen könnte beispielhaft für das Studium anderer Aspekte der Spore Keimung und Auswuchs.
Introduction
Ein wesentliches Ziel der Weltraumforschung ist die Suche nach Signaturen von Lebensformen und Biomolekülen auf andere Himmelskörper und Monde in unserem Sonnensystem. Die Übertragung von Mikroorganismen oder Biomoleküle irdischen Ursprungs zu kritischen Bereichen der Exploration ist besonders gefährdet, Einfluss auf die Entwicklung und die Integrität des Lebens-Erkennung Missionen auf Himmelskörper wie Mars und Europa1. Die internationalen Richtlinien der planetaren Schutz, gegründet 1967 durch Ausschuss Space Research (COSPAR) strenge Vorschriften für die bemannte und unbemannte Missionen zu anderen Planeten, deren Monde, Asteroiden und andere Himmelskörper zu verhängen und regulieren die Reinigung und Sterilisation von ein Raumschiff und kritischen Hardwarekomponenten vor, um Verunreinigung irdische Mikroorganismen zu beseitigen und zu verhindern Kreuzkontamination von Himmelskörpern2zu starten. Im letzten Jahrzehnt hat die Anwendung von nichtthermischen Plasmen breite Aufmerksamkeit in der biomedizinischen und ernährungswissenschaftliche Forschung sowie in Raumfahrt-Anwendungen3,4,5gewonnen. Plasmasterilisation ist eine vielversprechende Alternative zu herkömmlichen Sterilisationsmethoden, da sie schnelle und effiziente mikrobielle Inaktivierung6, dabei sanft, sensibel und labil Materialien Wärme bietet. Plasma-Entladungen enthalten eine Mischung aus reaktiven Substanzen wie freie Radikale, geladene Teilchen, Neutral/aufgeregt Atome, Photonen im Ultraviolett (UV) und Vakuum-Ultraviolett (VUV) Spektrum führen zu schnellen mikrobiellen Inaktivierung3. In dieser Studie verwenden wir Niederdruckplasma erzeugt durch doppelte Induktiv gekoppelte Niederdruck-Plasma (DICP) Quelle7,8 , um Bacillus Subtilis Endosporen verteilt auf Test Glasoberfläche zu inaktivieren.
Gram-positiven Bakterien der Familie Bacillaceae sind weit verbreitet in natürlichen Lebensräumen von Böden, Sedimenten und Luft sowie in außergewöhnlichen Umgebungen wie Reinraumanlagen und der internationalen Raumstation ISS9,10 ,11. Das auffälligste Merkmal der Gattung Bacillus ist die Fähigkeit, hochresistente ruhende Endosporen (nachfolgend Sporen) zu bilden, um ungünstige Bedingungen, wie z. B. Nährstoffverarmung12zu überleben. Sporen sind in der Regel wesentlich widerstandsfähiger als ihre Gegenstücke der vegetativen Zelle zu einer Vielzahl von Behandlungen und Umwelteinflüsse wie Hitze, UV, Gammabestrahlung, Austrocknung, mechanische Störungen und giftige Chemikalien, wie z. B. starken Oxidationsmitteln oder pH-Wert-Änderung Agenten (rezensiert in Referenzen13,14) und sind daher ideale Objekte zur Prüfung der Wirksamkeit von mikrobiellen Inaktivierungsverfahren. Da genomischer DNA ein wichtiges Ziel der Plasmabehandlung von Bakterien15,16, die Reparatur von Plasma-induzierten DNA-Läsionen ist (z. B. DNA-Doppelstrang Brüche) auf Spore Revival ist entscheidend für das Überleben der Bakterien13, 17.
So, wir studieren die Keimfähigkeit der Sporen und die Rolle der DNA-Reparatur während der Keimung der Spore und Auswuchs nach der Behandlung der Sporen mit Niederdruck-Argon-Plasma durch folgende einzelne Sporen und ihren Ausdruck der Fluoreszenz-markierten DNA zu reparieren RecA-Protein mit zeitaufgelösten konfokale Fluoreszenzmikroskopie. Wir geben eine Schritt für Schritt Anleitung für die Zubereitung von B. Subtilis Sporen in Monolagen zur Erreichung reproduzierbare Testergebnisse, die Behandlung von Spore Monolagen mit Niederdruck-Plasma für die Sterilisation, die Vorbereitung von Plasma behandelt Sporen für Ultrastrukturforschung Auswertung über Rasterelektronenmikroskopie (SEM) und live Zellanalyse Mikroskopie auf der Ebene der einzelnen Sporen im Konzert mit der Überwachung der aktiven DNS Reparatur Prozesse, die innerhalb der Zelle in Reaktion auf die Plasmabehandlung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sterilisation von Oberflächen mittels Niedertemperatur-Niederdruck-Plasma ist eine vielversprechende Alternative zu eher konventionelle Sterilisationsverfahren wie die Behandlung mit ionisierender Strahlung, Chemikalien (z.B. Gase wie H2O2 oder Ethylenoxid) oder trockene und feuchte Hitze23. Gewöhnliche Sterilisationsmethoden bieten meist eine effektive Sterilisation, aber sie sind dafür bekannt, die Einfluss auf des behandelten Materials und stellen ein potenziel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Andrea Schröder für ihre hervorragenden technischen Betreuung während Teile dieser Arbeit und Nikea J. Ulrich für ihre Unterstützung während dem Videodreh. Wir möchten auch Danke Lyle A. Simmons für seine großzügige Spende der Bacillus Subtilis Sorten: LAS72 und LAS24. Diese Arbeit wurde in Teilen durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728), PA (AW 7/3-1) unterstützt und der RM (MO 2023/2-1) und das DLR gewähren DLR-FuW-Projekt ISS Leben, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, M.R. und r.m.). F.M.F. wurde durch ein Promotionsstipendium der Helmholtz-Gemeinschaft Raum Life Sciences Research School (SpaceLife) am Deutschen Aerospace Center (DLR) in Köln, Deutschland, unterstützt von der Helmholtz-Gemeinschaft (Helmholtz-Gemeinschaft) über einen Zeitraum von sechs Jahren (finanziert wurde Grant Nr. VH-Ko-300) und erhielt zusätzliche Mittel von der DLR, einschließlich Luft-und Vorstand und dem Institute of Aerospace Medicine. Die Ergebnisse dieser Studie werden in der Dissertation von Felix M. Fuchs berücksichtigt.
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
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