लाइव सेल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर बैसिलस सबटिलिस बीजाणुओं के अस्तित्व पर कम दबाव प्लाज्मा नसबंदी के हानिकारक प्रभावों की जांच
Summary
इस प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण लगातार कदम पर नज़र रखने के द्वारा कम दबाव प्लाज्मा के साथ उपचार के बाद बैसिलस सबटिलिस बीजाणु को पुनर्जीवित करने में जीवन शक्ति पैरामीटर और डीएनए की मरंमत प्रक्रियाओं की प्रासंगिकता का आकलन करने के लिए आवश्यक दिखाता है प्रतिदीप्ति-बला समय के माध्यम से डीएनए की मरंमत प्रोटीन-संकल्पित फोकल माइक्रोस्कोपी और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी ।
Abstract
प्लाज्मा नसबंदी औद्योगिक, नैदानिक और spaceflight प्रयोजनों के लिए पारंपरिक नसबंदी तरीकों के लिए एक होनहार विकल्प है । कम दबाव प्लाज्मा (LPP) निर्वहन सक्रिय प्रजातियों, जो तेजी से माइक्रोबियल निष्क्रियता के लिए नेतृत्व की एक व्यापक स्पेक्ट्रम होते हैं । LPP द्वारा नसबंदी की दक्षता और तंत्र का अध्ययन करने के लिए, हम पारंपरिक बंध्याकरण प्रक्रियाओं के खिलाफ अपने असाधारण प्रतिरोध के कारण परीक्षण जीव बैसिलस सबटिलिस के बीजाणुओं का उपयोग करते हैं । हम सबटिलिस बीजाणु monolayers के उत्पादन का वर्णन, एक डबल inductively युग्मित प्लाज्मा रिएक्टर में कम दबाव प्लाज्मा द्वारा नसबंदी प्रक्रिया, बीजाणु के लक्षण विज्ञान स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) का उपयोग कर, और लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के द्वारा बीजों के अंकुरण और वृद्धि का विश्लेषण । प्लाज्मा प्रजातियों का एक प्रमुख लक्ष्य जीनोमिक सामग्री (डीएनए) और बीजाणु पुनर्जीवित पर प्लाज्मा प्रेरित डीएनए घावों की मरंमत जीव के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है । यहां हम बीजाणुओं की अंकुरण क्षमता और बीजाणु अंकुरण के दौरान डीएनए की मरंमत की भूमिका का अध्ययन करते है और समय-हल फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ फ्लोरोसेंट-बला डीएनए रिपेयर प्रोटीन (RecA) पर नज़र रखकर LPP के साथ उपचार के बाद वृद्धि करते हैं । इलाज और अनुपचारित बीजाणु monolayers अंकुरण के लिए सक्रिय कर रहे हैं और व्यक्तिगत बीजाणुओं की प्रतिक्रिया का पालन करने के लिए समय के साथ एक औंधा फोकल लाइव सेल माइक्रोस्कोप के साथ visualized. हमारी टिप्पणियों से पता चलता है कि अंकुरण और बीजाणुओं को कम करने का अंश LPP-उपचार की अवधि पर निर्भर है, १२० s. RecA-YFP (yellow प्रतिदीप्ति प्रोटीन) प्रतिदीप्ति के बाद केवल कुछ बीजाणुओं में पाया गया और सभी में विकसित LPP-उपचारित बीजाणुओं में थोड़ी सी ऊंचाई के साथ कोशिकाओं को तबदील करना । इसके अलावा, LPP-उपचारित बीजाणुओं से प्राप्त वनस्पति जीवाणुओं में से कुछ में कोशिका में वृद्धि हुई और लाइसे की प्रवृत्ति दिखाई दी । व्यक्तिगत बीजाणुओं के विश्लेषण के लिए वर्णित तरीके बीजाणु अंकुरण और वृद्धि के अन्य पहलुओं के अध्ययन के लिए अनुकरणीय हो सकते हैं ।
Introduction
अंतरिक्ष अन्वेषण का एक प्रमुख लक्ष्य जीवन रूपों और अन्य ग्रहों के शरीर और हमारे सौर मंडल में चंद्रमाओं पर अणुओं के हस्ताक्षर के लिए खोज है । सूक्ष्मजीवों या अंवेषण के महत्वपूर्ण क्षेत्रों के लिए स्थलीय मूल के अणुओं के हस्तांतरण विशेष रूप से इस तरह के मंगल और यूरोपा1के रूप में ग्रहों के शरीर पर जीवन का पता लगाने मिशन के विकास और अखंडता को प्रभावित करने के लिए जोखिम की है । ग्रहों की सुरक्षा के अंतर्राष्ट्रीय दिशानिर्देश, १९६७ में अंतरिक्ष अनुसंधान (COSPAR) की समिति द्वारा स्थापित, अंय ग्रहों, उनके चांद, क्षुद्रग्रह, और अंय खगोलीय पिंडों को आबाद और रोबोट मिशन पर सख्त नियमों थोपना और विनियमित सफाई और एक अंतरिक्ष यान और महत्वपूर्ण हार्डवेयर घटकों की नसबंदी के लिए शुरू करने से पहले प्रदूषित स्थलीय सूक्ष्मजीवों को खत्म करने और खगोलीय पिंडों के पार संक्रमण को रोकने के लिए2। पिछले दशक के दौरान, गैर थर्मल प्लाज्मा के आवेदन जैव चिकित्सा और पोषण अनुसंधान में व्यापक ध्यान प्राप्त किया है, साथ ही साथ spaceflight अनुप्रयोगों में3,4,5। प्लाज्मा नसबंदी पारंपरिक नसबंदी तरीकों के लिए एक होनहार विकल्प है के रूप में यह तेजी से और कुशल माइक्रोबियल निष्क्रियता प्रदान करता है6, जबकि संवेदनशील और गर्मी labile सामग्री के लिए कोमल जा रहा है । प्लाज्मा निर्वहन ऐसे मुक्त कण के रूप में प्रतिक्रियाशील एजेंटों का एक मिश्रण होते हैं, आरोप कणों, तटस्थ/उत्तेजित परमाणुओं, पराबैंगनी (यूवी) में फोटॉनों, और वैक्यूम पराबैंगनी (VUV) स्पेक्ट्रम जो तेजी से माइक्रोबियल निष्क्रियता के लिए सीसा3। इस अध्ययन में, हम कम दबाव प्लाज्मा डबल inductively युग्मित कम दबाव प्लाज्मा (DICP) स्रोत7,8 को निष्क्रिय बैसिलस सबटिलिस endospores ग्लास परीक्षण सतह पर वितरित द्वारा उत्पंन का उपयोग करें ।
ग्राम-परिवार के सकारात्मक जीवाणु Bacillaceae व्यापक रूप से मिट्टी, तलछट, और हवा के रूप में अच्छी तरह से साफ कमरे की सुविधा और अंतरराष्ट्रीय अंतरिक्ष स्टेशन के रूप में असामान्य वातावरण में के रूप में के रूप में के रूप में के प्राकृतिक निवास में वितरित कर रहे हैं9,10 ,11. जीनस बैसिलस की सबसे अलग विशेषता इस तरह के पोषक तत्वों की कमी के रूप में प्रतिकूल परिस्थितियों, जीवित रहने के लिए उच्च प्रतिरोधी सुप् endospores (इसके बाद बीजाणुओं के रूप में निर्दिष्ट) फार्म करने की क्षमता है12। बीजाणु आम तौर पर गर्मी, यूवी, गामा विकिरण, सुखाना, यांत्रिक व्यवधान, और ऐसे मजबूत ऑक्सीकरण रोधी के रूप में विषाक्त रसायनों, सहित उपचार और पर्यावरणीय तनाव की एक किस्म के लिए उनके वनस्पति कोशिका समकक्षों की तुलना में बहुत अधिक प्रतिरोधी रहे हैं पीएच-बदलते एजेंटों (संदर्भ में समीक्षा की13,14) और इसलिए माइक्रोबियल निष्क्रियता के तरीकों की दक्षता के परीक्षण के लिए आदर्श वस्तुएं हैं । चूंकि जीनोमिक डीएनए बैक्टीरिया15,16के प्लाज्मा उपचार का एक प्रमुख लक्ष्य है, जीवाणु पुनरुद्धार पर प्लाज्मा प्रेरित डीएनए घावों (जैसे डीएनए डबल किनारा टूटता है) की मरंमत13बैक्टीरिया के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, 17.
इस प्रकार, हम बीजाणुओं की अंकुरण क्षमता और बीजाणु अंकुरण के दौरान डीएनए की मरंमत की भूमिका और कम दबाव आर्गन प्लाज्मा के साथ बीजाणुओं के उपचार के बाद व्यक्तिगत बीजाणु और प्रतिदीप्ति-लेबल डीएनए की मरंमत की उनकी अभिव्यक्ति का अध्ययन समय के साथ प्रोटीन RecA-हल फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी । हम प्रतिलिपि परीक्षण परिणामों को प्राप्त करने के लिए monolayers में सबटिलिस बीजाणुओं की तैयारी के चरण निर्देश द्वारा एक कदम देते हैं , बंध्याकरण के लिए कम दबाव प्लाज्मा के साथ बीजाणु monolayers के उपचार, प्लाज्मा की तैयारी के लिए बीजाणुओं का इलाज ultrastructural मूल्यांकन स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM), और सक्रिय डीएनए की मरंमत के प्लाज्मा उपचार के जवाब में सेल के भीतर होने वाली प्रक्रियाओं की निगरानी के साथ संगीत कार्यक्रम में व्यक्तिगत बीजाणु के स्तर पर रहते सेल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण का उपयोग कर ।
Protocol
Representative Results
Discussion
कम तापमान का उपयोग कर सतहों की नसबंदी, कम दबाव प्लाज्मा इस तरह के विकिरण के साथ उपचार के रूप में बल्कि पारंपरिक नसबंदी प्रक्रियाओं के लिए एक होनहार विकल्प है, रसायन (एच2ओ2 की तरह गैसों केउदाहरण</e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस काम के कुछ हिस्सों के दौरान उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Andrea Schröder धंयवाद और वीडियो शूट के दौरान उसकी सहायता के लिए Nikea जे Ulrich । हम भी बैसिलस सबटिलिस उपभेदों: LAS72 और LAS24 के अपने उदार दान के लिए Lyle A. सिमंस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस काम के भागों में जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon पाक ७२८) फिलीस्तीनी अथॉरिटी (ऐडवर्ड्स 7/3-1) और RM (मो 2023/2-1) और डीएलआर अनुदान डीएलआर-FuW-Projekt आईएसएस जीवन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, programme RF-FuW, Teilprogramm ४७५ (टू एफ. एम. एफ., यूननट और R.M.) । F.M.F. Helmholtz अंतरिक्ष जीवन विज्ञान अनुसंधान स्कूल (SpaceLife) की एक पीएचडी छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित था जर्मन एयरोस्पेस केंद्र (डीएलआर) में कोलोन, जर्मनी, जो Helmholtz एसोसिएशन द्वारा वित्त पोषित किया गया (Helmholtz-Gemeinschaft) छह साल की अवधि में ( अनुदान सं. VH-KO-३००) और डीएलआर से अतिरिक्त धन प्राप्त किया, एयरोस्पेस कार्यकारी बोर्ड और एयरोस्पेस चिकित्सा संस्थान सहित । इस अध्ययन के परिणाम में पीएच. डी. फेलिक्स एम Fuchs की थीसिस को शामिल किया जाएगा ।
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
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