Undersøke den skadelige effekter av lav press plasmasterilisering på overlevelse av Bacillus subtilis Spores ved hjelp av Live celle mikroskopi
Summary
Denne protokollen illustrerer viktige sammenhengende trinn kreves for å vurdere relevansen av vitalitet parameteren og DNA reparasjon prosesser i gjenopplive Bacillus subtilis spores etter behandling med lavtrykk plasma av sporing fluorescens-merket DNA reparasjon proteiner via gang-løst AC confocal mikroskopi og skanning elektronmikroskop.
Abstract
Plasmasterilisering er et lovende alternativ til konvensjonelle sterilisering metodene for industrial, kliniske, og romfart. Lavtrykk plasma (LPP) utslipp inneholder et bredt spekter av aktiv arter, som fører til rask mikrobiell inaktivering. For å studere effektiviteten og mekanismer for sterilisering av LPP, bruker vi sporer av testen organismen Bacillus subtilis på grunn av deres ekstraordinære motstand mot konvensjonelle dampsterilisering. Vi beskriver produksjon av B. subtilis spore monolayers, steriliseringsprosessen av lavtrykk plasma i en dobbel Induktivt kombinert plasma reaktoren, karakterisering av spore morfologi bruker skanning elektronmikroskop (SEM), og analyse av spiring og utvekst av sporer av levende celle mikroskopi. Et mål av plasma arter er genomisk materiale (DNA) og reparasjon av plasma-indusert DNA lesjoner på spore revival er avgjørende for overlevelse av organismen. Her studerer vi spiring kapasitet sporer og rollen av DNA reparasjon spore spiring og resultatet etter behandling med LPP ved å spore fluorescently merket DNA reparasjon proteiner (RecA) med tid-løst fluorescens AC confocal mikroskopi. Behandlet og ubehandlet spore monolayers er aktivert for spiring og visualisert med en invertert AC confocal levende celle mikroskop over tid å følge reaksjonen av personlige sporer. Våre observasjoner viser at brøkdel av spirende og outgrowing sporer er avhengig av varigheten av LPP-behandlingen nå minst etter 120 s. RecA-YFP (gul fluorescens protein) fluorescens ble funnet i noen sporer og utviklet i alle outgrowing celler med en liten høyde i LPP-behandlet sporer. Videre noen av vegetative bakterier avledet fra LPP-behandlet sporer viste en økning i cytoplasma og tendens til å lyse. Beskrevet metoder for analyse av individuelle sporer kunne eksemplarisk for studier av andre aspekter av spore spiring og resultatet.
Introduction
Et hovedmål for romutforskning er Søk etter signaturer livsformer og biomolecules på andre planeter organer og månene i solsystemet. Overføring av mikroorganismer eller biomolecules Pǔtōnghuà til kritiske områder av leting er av spesiell risiko å påvirke av utvikling og livet-gjenkjenning oppdrag på planetenes organer som Mars og Europa1. Internasjonale retningslinjene for planetenes beskyttelse, etablert av komité for Space forskning (COSPAR) i 1967, innføre strenge regler på bemannet og robot oppdrag til andre planeter, deres måner, asteroider og andre himmellegemer og regulere den rengjøring og sterilisering et romskip og kritisk maskinvarekomponenter tidligere for å starte for å eliminere forurensende terrestriske mikroorganismer og forhindre kryss-kontaminering av himmellegemene2. Det siste tiåret, har anvendelse av ikke-termisk plasmas fått bred oppmerksomhet i biomedisinsk og ernæringsmessige forskning og romfart programmer3,4,5. Plasmasterilisering er et lovende alternativ til konvensjonelle sterilisering metoder som tilbyr rask og effektiv mikrobiell inaktivering6, samtidig som mild til sensitive og varme labil materialer. Plasma utslipp inneholder en blanding av reaktive stoffer som frie radikaler, ladede partikler, nøytral/glade atomer, fotoner i ultrafiolett (UV) og vakuum ultrafiolett (VUV) spektrum som fører til rask mikrobiell inaktivering3. I denne studien bruker vi lavt trykk plasma generert av dobbel Induktivt kombinert lavt trykk plasma (DICP) kilden7,8 for å deaktivere Bacillus subtilis endospores fordelt på test glassoverflaten.
Gram-positive bakteriene av familien Bacillaceae er svært utbredt i naturlige habitater av jord sedimenter og luften også som uvanlig miljøer som rene rom og den internasjonale romstasjonen9,10 ,11. Funksjonen mest tydelig i slekten Bacillus er evnen til å danne motstandsdyktige sovende endospores (heretter referert til som sporer) for å overleve ugunstige forhold, for eksempel næringsstoffer uttømming12. Sporene er generelt langt mer motstandsdyktig enn sine vegetative celle kolleger til en rekke behandlinger og miljømessige påkjenninger, inkludert varme, UV, gamma bestråling, uttørking, mekanisk avbrudd og giftige kjemikalier, som sterke oksidanter eller pH endring agenter (omtalt i referanser13,14) og er derfor ideelt objekter for å teste effektiviteten av mikrobielle inaktivering metoder. Siden genomisk DNA er et mål av plasma behandling av bakterier15,16, reparasjon av plasma-indusert DNA lesjoner (f.eks DNA dobbel-strand bryter) på spore revival er avgjørende for overlevelse av bakterier13, 17.
Dermed vi studere spiring kapasitet sporer og rollen til DNA reparasjon spore spiring og resultatet etter behandling spores med lavtrykk argon plasma av følgende personlige spores og deres uttrykk fluorescens-merket DNA reparasjon protein RecA med tid-løst fluorescens AC confocal mikroskopi. Vi gir en trinnvis instruksjon om utarbeidelse av B. subtilis sporer i monolayers for å oppnå reproduserbar testresultater, behandling av spore monolayers med lavtrykk plasma for sterilisering, utarbeidelse av plasma behandlet sporer for ultrastructural evaluering bruker skanning elektronmikroskop (SEM) og levende celle mikroskopi analyse på nivået av individuelle sporer sammen med overvåking aktive DNA reparasjon innenfor cellen i respons på plasma behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sterilisering av flater med lav temperatur, lavt trykk plasma er et lovende alternativ til heller vanlig dampsterilisering som behandling med ioniserende stråling, kjemikalier (f.eks gasser som H2O2 eller etylenoksid) eller tørr og fuktig varme23. Vanlige sterilisering metoder det meste gir en effektiv sterilisering, men de er kjent for å påvirke det behandlede materialet og representerer en potensiell risiko for operatøren. Lavt trykk plasma tilbyr en rask og h…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Andrea Schröder for hennes utmerket kundestøtte under deler av dette arbeidet og Nikea J. Ulrich for henne hjelp under video skyte. Vi vil også takke Lyle A. Simmons for sin generøse donasjonen av Bacillus subtilis stammene: LAS72 og LAS24. Dette arbeidet ble støttet i deler av tilskudd fra den tyske Research Foundation (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) til PA (AW 7/3-1) og RM (MO 2023/2-1) og DLR gi DLR-FuW-Projekt ISS livet, programmerbar RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, Mr og RM). F.M.F. ble støttet av en PhD-stipend i Helmholtz plass Life Sciences Research School (SpaceLife) på tysk Aerospace Center (DLR) i Köln, Tyskland, som ble finansiert av Helmholtz Association (Helmholtz-Gemeinschaft) over en periode på seks år ( Grant nr. VH-ko-300) og mottatt ytterligere midler fra DLR, inkludert luftfart styret og Institute of Aerospace Medicine. Resultatene av denne studien vil bli inkludert i doktorgrad Avhandlingen av Felix M. Fuchs.
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
Riferimenti
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR’s Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma – A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907 (2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D. Ecology of Bacillaceae. Microbiol Spectr. 3, (2015).
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W., Sneath, P. A. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2, 1105-1141 (1986).
- Setlow, P. Spore Resistance Properties. Microbiol Spectr. 2, (2014).
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P. Catabolic repression of bacterial sporulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 54, 704-711 (1965).
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v. The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826 (2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972 (2013).
