Utreda skadliga effekter av låg trycket Plasma sterilisering på överlevnaden för Bacillus subtilis sporer med Live Cell mikroskopi
Summary
Detta protokoll illustrerar de viktig på varandra följande steg krävs för att bedöma relevansen av övervakning vitalitet parametern och processer för DNA-reparationer i återuppliva Bacillus subtilis sporer efter behandling med lågtryck plasma av spårning fluorescens-märkt DNA reparation proteiner via tid-löst konfokalmikroskopi och svepelektronmikroskopi.
Abstract
Plasma sterilisering är ett lovande alternativ till konventionella sterilisering metoder för industri-, kliniska, och rymdfärder. Lågt tryck plasma (LPP) utsläpp innehåller ett brett spektrum av aktiva arter, som leder till snabb mikrobiell inaktivering. För att studera effektivitet och mekanismer för sterilisering av sekretess, använder vi sporer av testorganismen Bacillus subtilis på grund av sin extraordinära motstånd mot konventionella sterilisering procedurer. Vi beskriver produktionen av B. subtilis spore enskiktslager, steriliseringsprocessen av lågtryck plasma i en dubbel induktivt kopplad plasma reaktor, karakterisering av spore morfologi med scanning electron microscopy (SEM), och analys av grobarhet och utväxt av sporer av levande cell mikroskopi. Ett viktigt mål av plasma arter är genetiska material (DNA) och reparation av plasma-inducerad DNA lesioner på spore väckelse är avgörande för överlevnaden för organismen. Här studerar vi grobarheten av sporer och rollen av DNA reparation under sporgroning och utväxt efter behandling med LPP genom att spåra fluorescently-märkt DNA reparation proteiner (RecA) med tid-löst confocal fluorescensmikroskopi. Behandlade och obehandlade spore enskiktslager aktiveras för groning och visualiseras med en inverterad confocal levande cell Mikroskop över tid följa reaktionen av enskilda sporer. Våra observationer avslöjar att fraktionen av spira och outgrowing sporer är beroende av behandlingens längd LPP-nå ett minimum efter 120 s. RecA-YFP (gul fluorescens protein) fluorescens upptäcktes endast i några sporer och utvecklat i alla outgrowing celler med en lätt förhöjning i LPP-behandlade sporer. Dessutom några av de vegetativa bakterierna härrör från LPP-behandlade sporer som visade en ökning i cytoplasman och tenderade att lysera. De beskrivna metoderna för analys av enskilda sporer kan vara exemplariska för att studera andra aspekter av sporgroning och utväxt.
Introduction
Ett viktigt mål av utforskning av rymden är sökandet efter signaturer av livsformer och biomolekyler på andra planetariska kroppar och månarna i solsystemet. Överföring av mikroorganismer eller biomolekyler av terrestrial beskärningen till kritiska områden av utforskning är av särskild risk att påverka utveckling och integritet av liv-detection uppdrag på planetariska organ som fördärvar och Europa1. De internationella riktlinjerna för planetariska skydd, som fastställs av kommittén av utrymme forskning (COSPAR) 1967, införa strikta bestämmelser om bemannade och robotiserade uppdrag till andra planeter, månar, asteroider och andra himlakroppar och reglera den rengöring och sterilisering av ett rymdskepp och kritisk hårdvarukomponenter tidigare att lansera för att eliminera kontaminerande markbundna mikroorganismer och förhindra korskontaminering av himlakroppar2. Under det senaste decenniet, har tillämpningen av icke-termisk plasmor fått stor uppmärksamhet i biomedicinsk och näringsmässiga forskning samt i rymdfärder program3,4,5. Plasma sterilisering är ett lovande alternativ till konventionella sterilisering metoder eftersom den erbjuder snabb och effektiv mikrobiell inaktivering6, samtidigt som den är skonsam för känslig och värmen labila material. Plasma utsläpp innehåller en blandning av reaktiva ämnen såsom fria radikaler, neutral/upphetsad atomer, laddade partiklar, fotoner i ultraviolett (UV) och vakuum ultraviolett (VUV) spektrum som leder till snabb mikrobiell inaktivering3. I denna studie använder vi lågtryck plasma genereras av dubbel induktivt kopplade lågtryck plasma (DICP) källa7,8 för att inaktivera Bacillus subtilis endosporer fördelat på glasytan test.
Grampositiva bakterier av familjen Bacillaceae är spridda i livsmiljöer av jord, sediment och luft samt i ovanliga miljöer såsom rena rumsfaciliteter och den internationella rymdstationen9,10 ,11. Den mest tydliga inslaget i släktet Bacillus är förmågan att bilda Högresistent vilande endosporer (hädanefter benämnd sporer) för att överleva ogynnsamma förhållanden, till exempel näringsmässig utarmning12. Sporer är generellt mycket mer motståndskraftiga än motsvarigheterna vegetativ cell till en mängd olika behandlingar och miljöpåfrestningar, inklusive värme, UV, gammastrålning, uttorkning, mekaniska störningar och giftiga kemikalier, såsom kraftiga oxidationsmedel eller pH-ändra ombud (ses i referenser13,14) och är därför perfekt objekt för att testa effektiviteten av mikrobiell inaktivering metoder. Eftersom genomiskt DNA är ett viktigt mål av plasmabehandling av bakterier15,16, reparation av plasma-inducerad DNA lesioner (t.ex. dubbel DNA-strängen bryter) när spor revival är avgörande för överlevnaden av bakterier13, 17.
Således, vi studerar grobarheten av sporer och rollen av DNA-reparation under sporgroning och utväxt efter behandling av sporer med lågtryck argon plasma av följande enskilda sporer och deras uttryck för fluorescens-märkt DNA reparation protein RecA med tid-löst confocal fluorescensmikroskopi. Vi ger en steg för steg instruktion för beredning av B. subtilis sporer i enskiktslager för att uppnå reproducerbara testresultat, behandling av spore enskiktslager med lågtryck plasma för sterilisering, beredning av plasma behandlat sporer för ultrastrukturella utvärdering med hjälp av scanning electron microscopy (SEM) och levande cell mikroskopi analys på nivån för enskilda sporer i konsert med övervakning aktiv DNA reparation processer som sker i cellen i plasma behandlingssvaret.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sterilisering av ytor med låg temperatur, lågtryck plasma är ett lovande alternativ till ganska konventionell sterilisering procedurer såsom behandling med joniserande strålning, kemikalier (t.ex. gaser som H2O2 eller etylenoxid) eller torr och fuktig värme23. Vanlig sterilisering metoder ger oftast en effektiv sterilisering, men de är kända för att påverka det behandlade materialet och utgör en potentiell risk för operatören. Lågtryck plasma erbjuder e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Andrea Schröder för hennes utmärkta tekniska bistånd under delar av detta arbete och Nikea J. Ulrich för hennes hjälp under video skjuta. Vi vill också tacka Lyle A. Simmons för hans generösa donation av Bacillus subtilis stammar: LAS72 och LAS24. Detta arbete stöddes i delar av bidrag från den tyska Research Foundation (DFG) Paketantrag (PlasmaDecon PAK 728) till PA (AW 7/3-1) och RM (MO 2023/2-1) och DLR bevilja DLR-FuW-Projekt ISS liv, Programm RF-FuW, Teilprogramm 475 (F.M.F, M.R. och R.M.). F.M.F. stöddes av PhD stipendium för forskarskolan Helmholtz Space Life Sciences (SpaceLife) på den tyska rymdflygcentret (DLR) i Köln, Tyskland, som finansierades av Helmholtz Association (Helmholtz-Gemeinschaft) under en period av sex år ( Bidrag nr. VH-Ko-300) och fått ytterligare medel från DLR, inklusive Aerospace direktionen och Institutet för Aerospace medicin. Resultaten av denna studie inkluderas i doktorsavhandlingen av Felix M. Fuchs.
Materials
| Two substance nozzle (model 970-8) | Schlick | 14,404 | 230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter |
| Luria Bertani Medium | Sigma Aldrich | 70122-100G | |
| Tube connectors | Festo | n/a | G 1/8 |
| Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC | Bosch Rexroth | 820005100 | |
| PLN Polyamid tube | Festo | 558206 | d = 6 mm |
| Glass slides | VWR | 48300-026 | |
| Electric Timer 550-2-C | Gefran | F000074 | 220 V |
| attofluor cell chamber | Menzel, Fisher Ref. | 3406816 | d=25 mm, round |
| MgSO4*7 H2O | Sigma Aldrich | 13152 | |
| Ca(NO3)2 | Sigma Aldrich | 202967 | |
| MnCl2 * 4 H2O | Sigma Aldrich | 244589 | |
| FeSO4 * 7H2O | AppliChem | 13446-34-9 | |
| Glucose | Merck | 215422 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Nutrient Broth (NB) | Merck | 105443 | |
| Luria-Bertani (LB) | Merck | 110283 | |
| 96-wellplate | ThermoFisher | 243656 | |
| Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| Leo 1530 Gemini | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | n/a | |
| SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software) | Systat GmbH, Erkrath, Germany | n/a | |
| Attofluor cell chamber | Invitrogen | A7816 | |
| µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom | ibidi | 81168 |
Riferimenti
- Nicholson, W. L., Schuerger, A. C., Race, M. S. Migrating microbes and planetary protection. Trends Microbiol. 17, 389-392 (2009).
- COSPAR. COSPAR Planetery Protection Policy. Space Research Today, COSPAR’s Information Bulletin. 193, 1-14 (2015).
- De Geyter, N., Morent, R. Nonthermal plasma sterilization of living and nonliving surfaces. Annu Rev Biomed Eng. 14, 255-274 (2012).
- Shimizu, S., et al. Cold atmospheric plasma – A new technology for spacecraft component decontamination. Planet. Space Sci. 90, 60-71 (2014).
- Lerouge, S., Fozza, A. C., Wertheimer, M. R., Marchand, R., Yahia, L. H. Sterilization by Low-Pressure Plasma: The Role of Vacuum-Ultraviolet Radiation. Plasma Polym. 5, 31-46 (2000).
- Rossi, F., Kylián, O., Rauscher, H., Gilliland, D., Sirghi, L. Use of a low-pressure plasma discharge for the decontamination and sterilization of medical devices. Pure Appl. Chem. 80, 1939-1951 (2008).
- Halfmann, H., Hauser, J., Awakowicz, P., Koller, M., Esenwein, S. A. A double inductively coupled low-pressure plasma for sterilization of medical implant materials. Biomed Tech (Berl). 53, 199-203 (2008).
- Halfmann, H., Denis, B., Bibinov, N., Wunderlich, J., Awakowicz, P. Identification of the most efficient VUV/UV radiation for plasma based inactivation of Bacillus atrophaeus spores. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 5907 (2007).
- Vaishampayan, P., et al. Bacillus horneckiae sp. nov., isolated from a spacecraft-assembly clean room. Int J Syst Evol Microbiol. 60, 1031-1037 (2010).
- Mandic-Mulec, I., Stefanic, P., van Elsas, J. D. Ecology of Bacillaceae. Microbiol Spectr. 3, (2015).
- Alekhova, T. A., et al. Diversity of bacteria of the genus Bacillus on board of international space station. Dokl Biochem Biophys. 465, 347-350 (2015).
- Claus, D., Bekerley, R. C. W., Sneath, P. A. Genus Bacillus Cohn 1872. Bergey’s manual of systematic bacteriology. 2, 1105-1141 (1986).
- Setlow, P. Spore Resistance Properties. Microbiol Spectr. 2, (2014).
- Setlow, P. Spores of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J Appl Microbiol. 101, 514-525 (2006).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Characterization of Bacillus subtilis spore inactivation in low-pressure, low-temperature gas plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 108, 521-531 (2010).
- Roth, S., Feichtinger, J., Hertel, C. Response of Deinococcus radiodurans to low-pressure low-temperature plasma sterilization processes. J Appl Microbiol. 109, 1521-1530 (2010).
- Setlow, B., Setlow, P. Role of DNA repair in Bacillus subtilis spore resistance. J Bacteriol. 178, 3486-3495 (1996).
- Schaeffer, P., Millet, J., Aubert, J. P. Catabolic repression of bacterial sporulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 54, 704-711 (1965).
- Simmons, L. A., et al. Comparison of responses to double-strand breaks between Escherichia coli and Bacillus subtilis reveals different requirements for SOS induction. J Bacteriol. 191, 1152-1161 (2009).
- Raguse, M., et al. Improvement of Biological Indicators by Uniformly Distributing Bacillus subtilis Spores in Monolayers To Evaluate Enhanced Spore Decontamination Technologies. Appl Environ Microbiol. 82, 2031-2038 (2016).
- Horneck, G., et al. Protection of bacterial spores in space, a contribution to the discussion on Panspermia. Orig Life Evol Biosph. 31, 527-547 (2001).
- Opretzka, J., Benedikt, J., Awakowicz, P., Wunderlich, J., Keudell, A. v. The role of chemical sputtering during plasma sterilization of Bacillus atrophaeus. J. Phys. D: Appl. Phys. 40, 2826 (2007).
- Stapelmann, K., et al. Utilization of low-pressure plasma to inactivate bacterial spores on stainless steel screws. Int. J. Astrobiol. 13, 597-606 (2013).
- Raguse, M., et al. Understanding of the importance of the spore coat structure and pigmentation in the Bacillus subtilis spore resistance to low-pressure plasma sterilization. J. Phys. D: Appl. Phys. 49, 285401 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS one. 8, e58972 (2013).
