Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi

Sommario

Liquefazione dello sperma è richiesto per gli spermatozoi di essere liberato dal gel seminale. Questo studio fornisce le procedure per la raccolta dello sperma dal post-coito tratto riproduttivo femminile e misurazione del tempo di liquefazione dello sperma.

Abstract

In topi, sperma eiaculato è depositato nell'utero. Dopo l'eiaculazione, lo sperma cambia consistenza da gel-like a acquoso, un processo chiamato liquefazione. In questo studio, mostriamo come raccogliere il post-eiaculato sperma dal tratto riproduttivo femminile in un modello murino. In primo luogo, adulti topi femminili in fase di estro sono stati alloggiati nella gabbia del maschio durante la notte. La mattina successiva, copulazione è stata confermata dalla presenza di copulatoria spina all'apertura vaginale. I topi femminili con spine copulatore sono stati eutanasizzati e ogni tratto riproduttivo è stato raccolto nel suo complesso (vagina, utero, ovidotti, ovaie), garantendo un sistema chiuso per contenere lo sperma. Il tratto riproduttivo è stato disposto in una microcentrifuga da 1,5 mL, e la vagina è stata tagliata fuori per liberare il suo sperma nel tubo. Per garantire il volume di sperma massimo per l'analisi, senza denti forcipe sono stato utilizzato per spremere i corni uterini da ovarico fine a fine vaginale espellendo lo sperma restante. Il tratto intero riproduttivo è stato poi scartato. Il tubo che contiene lo sperma era filato brevemente verso il basso. Una pipetta capillare 25 μL è stato disposto nel tubo ad un angolo di 180° (parallela alla parete del tubo). La quantità di tempo utilizzato per riempire il tubo capillare alla riga 25 μL è stata registrata. Sperma da un allevatore provato maschio di solito prende circa 60-180 s per riempire un tubo capillare di 25 μL. Questa tecnica di raccolta dello sperma è utilizzabile anche in altre applicazioni a valle quali analisi di imaging e la motilità dello sperma.

Introduzione

Il tratto riproduttivo femminile comprende i tratti superiori e inferiori. Il tratto riproduttivo superiore include Tube di Falloppio, l'utero e l'endocervice. Il tratto riproduttivo inferiore comprende l'esocervice e vagina. In esseri umani, lo sperma eiaculato è depositato presso la parete anteriore della vagina, adiacente al ectocervix¹. In topi, tuttavia, lo sperma è spazzato in utero pochi minuti dopo l'accoppiamento di².

Lo sperma contiene gel seminale che si solidifica in pochi secondi di eiaculazione, causando lo sperma per essere intrappolati e immobilizzato³. ....

Protocollo

Tutti gli animali e le procedure utilizzate in questo studio sono state gestite secondo orientamenti Comitato di uso e cura degli animali di Washington State University (WSU) e in conformità a protocolli animale WSU-approvato 4702 # e #4735.

1. topi

1. Utilizzare standard topi del maschio adulto C57BL/6J o altri ceppi di interesse. Mantenere gli animali in un ambiente di temperatura e umidità controllata, con accesso ad libitum di acqua e cibo.
   1. Utilizzare riproduttori maschi che vanno da 8 settimane a 10 mesi di età. Utilizzare solo gli allevatori provati negli esperimenti.
2. ....

Risultati

Lo sperma è stato raccolto da CTRL e KO femmine circa 8 h dopo l'accoppiamento con i maschi fertili di CTRL. Liquefazione (o viscosità del liquido seminale) è quantificata mediante il tempo impiegato per riempire il tubo capillare di 25 μL di sperma. Lo sperma raccolto da uteri di CTRL preso 2,06 ±0.12 min (mean±S.E.M, n = 5) per riempire il tubo capillare (Figura 1). Tuttavia, lo sperma raccolto da uteri di KO ha avuto più di 60 min (60,0 ' di ± 0.0, mean±S.E.M, n = 5) di .......

Discussione

Raccolta di sperma da uteri del mouse possa fornire vantaggi rispetto sperma analisi in vitro come l'ex può illustrare le interazioni fisiologiche tra lo sperma e le secrezioni dal tratto riproduttivo femminile. Le tecniche presentate in questo studio permettono ai ricercatori di determinare la qualità dello sperma nonché la vitalità degli spermatozoi e la motilità in condizioni fisiologiche ideali. Inoltre, ci sono varie analisi a valle che possono essere eseguite utilizzando lo sperma raccolto dalla u.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Stuzzicadenti	Diamond	750-Flat	Autoclavato sterile, utilizzare stuzzicadenti smussato. Non utilizzare
forbici da dissezione	Fisher	08-940
Forbici a molla	Roboz	RS-5600
Pinze fini	Roboz	RS-5045
25-μ Tubo capillare in vetro L	VWR	53432-761
Leibovitz' s Terreni L-15	Life Technologies	Integratore con l'1% di FBS
Siero fetale bovino (FBS)	Gemini Bio-Products	100-106
Provetta per microcentrifuga da 1,5 ml	Axygen	MCT-150-C
Provetta per microcentrifuga da 2 ml	Axygen	MCT-200-A
Riscaldatore digitale a blocco secco	VWR	13259-052	Per riscaldare la provetta per microcentrifuga prima della raccolta dello sperma
Minicentrifuga	Corning	LSE 6765
Piatto di coltura da 35 mm	VWR	10861-656
Provetta da centrifuga in polipropilene da 15 ml	VWR	10025-686
Bagno d'acqua	Precisione	TSGP05
Stereomicroscopio a tavolino riscaldato	Leica Microsystems	MZ10F	Per mantenere caldo il tessuto prima di
Microscopio a campo chiaro	Leica Microsystems	DMi8	Opzionale. Per l'imaging video della motilità degli spermatozoi
la fotocamera	Leica Microsystems	DMC2900	opzionale. Per l'imaging video della motilità degli spermatozoi
Vetrini Fisher		12-552-3	Opzionale. Per l'imaging video della motilità degli spermatozoi
Vetrino coprioggetti	VWR	48393-059	Opzionale. Per l'imaging video della motilità degli spermatozoi
candeggina			diluire in dH2O al 10% di concentrazione

a punta 11415064 , , ,