Verzameling na paring sperma van de vrouwelijke voortplantingssysteem en de waardering van sperma vloeibaar in muizen
Summary
Sperma vloeibaar is vereist voor sperma worden bevrijd van de rudimentaire gel. Deze studie bevat de procedures voor het verzamelen van sperma van de vrouwelijke voortplantingssysteem na coïtus en sperma vloeibaar tijdmeting.
Abstract
Bij muizen, wordt ejaculated sperma gestort in de baarmoeder. Na ejaculatie, verandert het sperma consistentie van gel-achtige te waterig, een proces dat vloeibaar. In deze studie, we laten zien hoe het na ejaculated sperma van het vrouwelijke voortplantingssysteem in een muismodel verzamelen. Eerste, volwassen vrouwelijke muizen in de estrus fase werden gehuisvest in een man de kooi ‘s nachts. De volgende ochtend, werd copulatie bevestigd door de aanwezigheid van copulatory stekker aan de vaginale opening. Vrouwelijke muizen met copulatory stekkers waren euthanized, en elke voortplantingssysteem verzameld als geheel (vagina, baarmoeder, oviducts, eierstokken), zorgen voor een gesloten systeem om te bevatten het sperma. Het voortplantingskanaal werd geplaatst in een tube van 1,5 mL microcentrifuge, en de vagina werd afgesneden vrij te geven van het sperma in de buis. Om ervoor te zorgen maximale sperma volume voor analyse, tandeloze pincet dienden te knijpen de baarmoeder horens van ovariële einde vaginale daartoe resterende sperma verdrijven. Het hele voortplantingskanaal werd vervolgens weggegooid. De sperma-bevattende buis was kort gesponnen beneden. Capillaire Pipetteer 25 μL werd geplaatst in de buis onder een hoek van 180° (parallel aan de buiswand). De hoeveelheid tijd gebruikt voor het vullen van het capillair aan de 25 μL lijn werd opgenomen. Sperma van een bewezen mannelijke Fokker duurt meestal ongeveer 60-180 s tot een capillaire buis van 25 μL. Dit sperma collectie techniek kan ook worden gebruikt in andere downstream toepassingen zoals sperma beeldvorming en motiliteit analyse.
Introduction
Het vrouwelijke voortplantingssysteem bestaat uit de bovenste en onderste traktaten. Het bovenste voortplantingskanaal omvat de eileiders, de baarmoeder en de endocervix. Het lagere voortplantingskanaal omvat de ectocervix en de vagina. Bij de mens, wordt het ejaculated sperma gestort op de voorste wand van de vagina, grenzend aan de ectocervix1. Bij muizen, echter is het sperma veegde in de baarmoeder binnen minuten na de paring2.
Sperma bevat baanbrekende gel die is verhard binnen seconden na de ejaculatie, waardoor het sperma te worden in de val gelokt en3geïmmobiliseerd. Vloeibaar brengt het geïmmobiliseerdet sperma door sperma van een gel-achtige omzetten in een waterige consistentie. Dit proces is essentieel voor de beweeglijkheid van de zaadcellen en zoogdieren reproductie. Kennis van sperma vloeibaar is meestal gebaseerd op in vitro studies waar sperma wordt vloeibaar in een cultuur schotel. Bij de mens is de enzymatische activiteit van prostaat specifiek antigeen of PSA (ook bekend als kallikrein-gerelateerde peptidase 3 of KLK3) de grootste bijdrage voor vloeibaar maken door middel van hydrolyse van semenogelins (gel-vormende aanwezige eiwitten in het sperma)4 ,5,6. Afbraak van semenogelins bevrijdt het sperma van de baanbrekende coagulum, mobiliteit van sperma. Bevrijd zaadcellen zwemmen naar de eileider te bevruchten het ei. Vloeibaar (of sperma viscositeit) tests zijn een van de standaard eerste screenings voor semenanalyse in vruchtbaarheid klinieken te beoordelen van de mannelijke vruchtbaarheid7.
Een onlangs gepubliceerde artikel toont aan dat de analyse van zaadvocht vloeistof verzameld uit de vrouwelijke muis voortplantingssysteem na de paring kan worden gebruikt ter illustratie van een tekort aan vloeibaar dat vervolgens leiden vruchtbaarheid gebreken8 tot kan. Defecte vloeibaar zoals sperma hyperviscosity draagt bij aan 11,8-32.3% van onvruchtbaar gevallen in mannen9, suggereert dat de normale vloeibaar onmisbaar voor de voortplanting van de zoogdieren is. Echter, studies en de behandeling van vloeibaar gebreken hebben uitsluitend gericht op de mannelijke7. De mogelijkheid dat het vrouwelijke voortplantingssysteem een rol in het sperma vloeibaar speelt is niet onderzocht. Daarom zal de methoden voor sperma en vloeibaar meettijd bieden onderzoekers een nieuwe diagnostische tool om te bepalen of vloeibaar maken één van de oorzaken van onvruchtbaarheid bij de modelorganisme van belang zou kunnen zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voordelen ten opzichte van sperma analyse in vitro kan verzamelen van sperma van muis baarmoeders geven, zoals de voormalige de fysiologische interacties tussen het sperma en de afscheidingen van de vrouwelijke voortplantingssysteem. illustreren kunt De technieken gepresenteerd in deze studie laten onderzoekers om sperma kwaliteit evenals sperma levensvatbaarheid en beweeglijkheid in ideale fysiologische omstandigheden te bepalen. Bovendien zijn er diverse downstream analyses die kunnen worden uitgevoer…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk wordt ondersteund door College voor diergeneeskunde (WSU) startfonds, gevormd op WW. De auteurs bedanken Sierra Olsen (WSU) voor de kritische lezing van dit manuscript.
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
Riferimenti
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
