Induzione della ricombinazione di Cre-lox nella corteccia cerebrale del Mouse attraverso elettroporazione In Utero

Katherine M. Bland; Zachary O. Casey; Christopher J. Handwerk; Z. Logan Holley; George S. Vidal

doi:10.3791/56675

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Articolo metodologico

Induzione della ricombinazione di Cre-lox nella corteccia cerebrale del Mouse attraverso elettroporazione In Utero

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DOI:

10.3791/56675

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17 novembre 2017

Katherine M. Bland^*¹ , Zachary O. Casey^*¹ , Christopher J. Handwerk^*¹ , Z. Logan Holley¹ , George S. Vidal¹

¹Department of Biology, James Madison University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Cella-autonome funzioni dei geni nel cervello possono essere studiate inducendo perdita o guadagno di funzione in popolazioni sparse delle cellule. Qui, descriviamo in utero elettroporazione per consegnare la Cre ricombinasi nelle popolazioni sparse di sviluppare neuroni corticali con floxed geni per causare la perdita di funzione in vivo.

Abstract

Cella-autonome funzioni neuronali dei geni possono essere rivelate causando perdita o guadagno di funzione di un gene in una popolazione di piccola e sparsa di neuroni. Per effettuare questa operazione richiede la generazione di un mosaico in cui i neuroni con perdita o guadagno di funzione di un gene sono circondati da tessuto geneticamente imperturbato. Qui, uniamo il sistema di ricombinazione di Cre-lox con elettroporazione nell'utero al fine di generare tessuto cerebrale mosaico che può essere utilizzato per studiare la funzione delle cellule-autonoma dei geni nei neuroni. Costrutti del DNA (disponibili nei repository), che codifica per un'etichetta fluorescente e la Cre ricombinasi, vengono introdotti nello sviluppo di neuroni corticali contenenti geni affiancati con siti loxP nei cervelli degli embrioni del mouse utilizzando in utero elettroporazione. Inoltre, descriviamo vari adattamenti per il metodo di elettroporazione nell'utero che aumentano la sopravvivenza e la riproducibilità. Questo metodo coinvolge anche stabilire un titolo per ricombinazione Cre-mediata in una rada o densa popolazione di neuroni. Preparati istologici del tessuto cerebrale con etichetta non richiedono (ma può essere adattati a) immunohistochemistry. I costrutti utilizzati garantiscono che fluorescente etichettati neuroni trasportare il gene per la ricombinasi Cre. Preparati istologici consentono analisi morfologica dei neuroni confocale imaging delle pergole dentritici ed axonal e spine dendritiche. Perché perdita o guadagno di funzione è realizzato in tessuto di tipo sparse mosaico, questo metodo consente lo studio delle necessità delle cellule autonome e la sufficienza della gene prodotti in vivo.

Introduzione

Generando un mosaico genetico è un classico paradigma sperimentale per comprendere la funzione di un gene di interesse. Per determinare se un gene è necessario per un fenotipo cellulare, l'approccio più semplice è causando una perdita di funzione del gene in tutto l'organismo (ad es. ad eliminazione diretta). Tuttavia, per determinare se un gene è necessaria in particolare in un determinato tipo di cellula, knockout del gene in tutto l'organismo non è un approccio valido. Al contrario, è necessario un metodo che causerà la perdita di funzione di un gene in una determinata cella mentre è circondato da tessuto wildtype (cioè geneticamente imperturbata)....