Articolo metodologico

Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

DOI:

10.3791/56678

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24 maggio 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, 2School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, 3Department of Laboratory Medicines, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region, Southern Medical University, 4Experiment Teaching Center, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive i metodi per registrare la risposta uditiva del tronco cerebrale da cuccioli del ratto postnatale. Per esaminare lo sviluppo funzionale di cellule ciliate esterne, la procedura sperimentale del morsetto della intero-cellula patch registrazione in cellule ciliate esterne isolate è descritta passo dopo passo.

Abstract

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L'esterno della cellula ciliata è uno dei due tipi di cellule ciliate sensoriali nella coclea dei mammiferi. Essi alterano la loro lunghezza di cella con il recettore potenziale per amplificare la vibrazione debole del segnale a basso livello sonoro. La morfologia e la proprietà elettrofisiologiche delle cellule ciliate esterne (OHCs) si sviluppano in età postnatale precoce. La maturazione della cellula ciliata esterna può contribuire allo sviluppo del sistema uditivo. Tuttavia, il processo di sviluppo di OHCs non è ben studiato. Questo è in parte a causa della difficoltà per misurare la loro funzione da un approccio elettrofisiologico. Con lo scopo di sviluppare un metodo semplice per risolvere il problema di cui sopra, qui descriviamo un protocollo dettagliato per studiare la funzione di OHCs nella coclea acutamente dissociato da ratti postnatali. Con questo metodo, possiamo valutare la risposta coclea agli stimoli di tono puro ed esaminare il livello di espressione e la funzione della proteina motore prestin nel OHCs. Questo metodo può anche essere utilizzato per studiare le cellule ciliate interne (IHCs).

Introduzione

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Due funzioni distinte di cellule ciliate sensoriali cocleari sono essenziali per l'udito dei mammiferi: trasduzione del mechanoelectric (MET) ed electromotility1,2. Dai canali MET situati nel fascio di capelli, IHCs (IHCs) e OHCs Converti vibrazione sonora in variazioni di potenziale di membrana, come pure i segnali elettrici dei neuroni del ganglio spirale innervate. OHCs cambiano la loro lunghezza di cella con il potenziale di membrana e amplificare la vibrazione del suono di basso livello. Questa attività definita electromotility è derivata dalla proteina motore prestin situato nella parete laterale del OHC....

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Protocollo

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Tutti i protocolli sperimentali che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal comitato di etica animale dell'Università medica del sud.

1. preparare le soluzioni per gli esperimenti

  1. Preparare l'anestetico (Vedi Tabella materiali): sodio pentobarbital 1,5% disciolto in ddH2O.
  2. Preparare la soluzione di dissezione (Vedi Tabella materiali): sciogliere un sacchetto di polvere di L-15 di Leiboviz in 1 L di ddH2O. Adjust pH a 7,3 con 1 M NaOH. Regolare osmolarità di 300-330 mOsm utilizzando un Osmometro e 10 mM HEPES prima dell'uso.
  3. Sciogliere 2 mg/mL....

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Risultati

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ABR può essere suscitata da cuccioli del ratto anestetizzato oltre postnatale giorno 7 anni di età (P7) utilizzando gli scoppi di tono puro (Figura 1A). Come mostrato in Figura 1B, le forme d'onda ABR ottenuti da cuccioli del ratto ha mostrati solo tre o quattro distinte ondate con piccola ampiezza. Di solito, fino a sette cime sono state osservate nelle forme d'onda ABR di animali adulti (Figura 1B).......

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Discussione

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In ratti più giovani di giorno 11, nessun potenziale d'azione in risposta a stimolazione sonora potrebbe essere osservato nella corteccia uditiva6,7. Di conseguenza, postnatale giorno 11 è descritto come "inizio dell'udito"10. Lo sviluppo della funzione uditiva prima insorgenza di udienza non è stato ben studiato ancora. Utilizzando il metodo simile per la registrazione di ABR adulto, dimostriamo che ABRs potrebbe essere suscitata da scopp.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal programma del 973 (2014CB943002) e il National Natural Science Foundation della Cina (11534013, 31500841).

....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anestetico
Pentobarbital sodicoSigmaP37611,5% in acqua
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Soluzione di dissezione
Leiboviz's L-15 MediumLife Technologies41300-0391 confezione in 1 L di acqua
Collagenasi IV SigmaC51382 mg/mL in L-15
HEPESSigma7365-45-910 mM
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Soluzioni immunocoloranti
PBSThermo Fisher Scientific 10010023PH 7,3
ParaformaldeideSigma1581274% in PBS
Triton X-100AmrescoZS-06940,3% in PBS
Siero normale di capraThermo Fisher Scientific10000C10% in PBS
anticorpo prestinSanta CruzSC-22694dil 1:200
Alexa Fluor 488-anticorpo coniugatoThermo Fisher ScientificA-11055dil 1:600
Falloidina-Tetrametilrodamina B isotiocianatoSigmaP1951dil 1:200
DAPISolarbioC0060dil 1:20
Nome AziendaNumero di catalogoComments
Soluzione extracellulare
Leiboviz's L-15 MediumLife Technologies41300-0391 confezione in 1 L di acqua
HEPESSigma7365-45-910 mM
NomeAziendaNumero catalogoComments
Soluzione intracellulare
CsClSigma7647-17-8140 mM
MgCl2Sigma7791-18-62 mM
EGTASigma67-42-510 mM
HEPESSigma7365-45-910 mM<
strong>NomeAziendaNumero di catalogoComments
>Equipment
OsmometroGonotecOSMOMAT 3000 Basic
ForcepWPI14095Pinzette dumont
Estrattore per micropipetteStrumentoSutter MODLE-P97
Micro ForgeNarishigenMF-830
Mini sistema operativoStrumento SutterMP-285
MultiClampAxon700B
Sistema di acquisizione dati a basso rumoreAxon1440A
ES1 relatoreTucker-Davis Technologies
Sistema TDT 3Tucker-Davis Technologies
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Software
SigGenRP softwareTucker-Davis Technologies
Software BioSigRPTucker-Davis Technologies
jClampScientific Solutions
NameAziendaNumero di catalogoComments
Animal Animale Sperimentale per Ratti >
SDdella Southern Medical University

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. He, D. Z., Zheng, J., Kalinec, F., Sacchi Kakehata, S. S. antos-, J, Tuning in to the amazing outer hair cell: membrane wizardry with a twist and shout. J Membr Biol. 209, 119-134 (2006).
  2. Dallos, P. Cochlear amplification, outer hair cells and prestin. Curr Opin N....

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Tag

Cellule ciliate cocleariEspressione della prestinaMicroscopia confocaleDigestione tissutaleIsolamento delle cellule ciliateRegistrazione elettrofisiologica

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