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Developmental Biology

न्यूरॉन्स में Intracellular परिवहन का विश्लेषण करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस के स्थिरीकरण

Published: October 18, 2017 doi: 10.3791/56690
Automatic Translation
1
1Frontier Research Institute for Interdisciplinary Sciences and Graduate School of Life Sciences, Tohoku University

Summary

Caenorhabditis एलिगेंस (ग. एलिगेंस) axonal और intracellular परिवहन का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल है । यहां, मैं vivo रिकॉर्डिंग और सी. एलिगेंसमें axonal और intraflagellar परिवहन के विश्लेषण में के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन ।

Abstract

Axonal ट्रांसपोर्ट और intraflagellar ट्रांसपोर्ट (IFT) axon और cilia morphogenesis और फंक्शन के लिए जरूरी हैं । Kinesin superfamily प्रोटीन और dynein आणविक मोटर्स हैं जो क्रमशः anterograde और प्रतिगामी परिवहन को विनियमित करती हैं । इन मोटर्स रेल के रूप में microtubule नेटवर्क का उपयोग करें । Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) विवो मेंaxonal ट्रांसपोर्ट और IFT का अध्ययन करने वाला एक शक्तिशाली मॉडल जीव है । यहां, मैं एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए axonal परिवहन और IFT में रहने वाले सी. एलिगेंसका निरीक्षण । उत्पात कार्गो ऐसे ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग कर कार्गो प्रोटीन टैगिंग द्वारा visualized किया जा सकता है । C. एलिगेंस पारदर्शी और GFP-चिह्नित कार्गो प्रोटीन सेल विशिष्ट प्रवर्तकों के तहत विशिष्ट कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है । जीवित कीड़े की हत्या या कीड़े anesthetizing बिना 10% agarose जेल पर microbeads द्वारा तय किया जा सकता है । इन शर्तों के तहत, कार्गो आंदोलन सीधे axons और विच्छेदन के बिना रहने वाले सी. एलिगेंस के cilia में मनाया जा सकता है । इस विधि को लक्षित प्रोटीन और/या वे में व्यक्त कर रहे है कोशिकाओं को संशोधित करके किसी भी कोशिकाओं में किसी भी कार्गो अणु के अवलोकन के लिए लागू किया जा सकता है । अधिकांश बुनियादी प्रोटीन जैसे आणविक मोटर्स और एडेप्टर प्रोटीन है कि axonal परिवहन और IFT में शामिल कर रहे हैं के संरक्षण में है C. एलिगेंस। अन्य मॉडल जीवों की तुलना में, म्यूटेंट को प्राप्त किया जा सकता है और अधिक आसानी से C. एलिगेंसमें बनाए रखा । विभिन्न सी. एलिगेंस म्यूटेंट के साथ इस विधि का मेल axonal परिवहन और IFT के आणविक तंत्र को स्पष्ट कर सकता है.

Introduction

लाइव सेल इमेजिंग intracellular परिवहन का विश्लेषण करने के लिए एक आवश्यक उपकरण है । न्यूरॉन सेल जीव विज्ञान में, लाइव सेल इमेजिंग के साथ axonal परिवहन के विश्लेषण ंयूरॉन समारोह और morphogenesis1समझने के लिए आवश्यक हैं । axonal परिवहन में दोष आबाद अनेक neurodegenerative विकार२. Kinesin superfamily प्रोटीन और dynein ले axonal परिवहन anterogradely और प्रतिगामी, क्रमशः1,2।

Cilia एक और सेलुलर कम्पार्टमेंट हैं जिसमें microtubule नेटवर्क और तस्करी मशीनरी को अत्यधिक विकसित किया गया है3. प्रोटीन संश्लेषण मशीनरी cilia में स्थानीयकृत नहीं है, जिसका अर्थ है कि सिलिअरी प्रोटीन को कोशिका से cilia युक्तियों तक पहुँचाया जाना चाहिए. Cilia-विशिष्ट kinesin और dynein, जिसे kinesin-2 और cytoplasmic dynein-2 कहा जाता है, क्रमशः Cilia ट्रांसपोर्ट (intraflagellar)5नामक एक घटना में,6-6 के घटकों का परिवहन करते हैं । IFT की हानि ciliopathies6नामक रोगों की एक स्पेक्ट्रम का कारण बनता है । इस प्रकार, लाइव सेल इमेजिंग द्वारा IFT तंत्र का विश्लेषण सिलिअरी गठन और रोगजनन के बुनियादी तंत्र को समझने की आवश्यकता है ।

Caenorhabditis एलिगेंस (ग. एलिगेंस) axonal परिवहन और IFT7,8,9का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल है । IFT का निरीक्षण करने के लिए, Chlamydomonas व्यापक रूप से एक मॉडल जीव5,6के रूप में इस्तेमाल किया गया है । के रूप में Chlamydomonas एक कोशिकीय जीव है, उंर बढ़ने के साथ IFT का रिश्ता, ंयूरॉन समारोह, और व्यवहार को विश्लेषण मुश्किल होगा । इसके अलावा, CRISPR/Cas9 जैसे आवश्यक आनुवंशिक तकनीकों को Chlamydomonasपर लागू नहीं किया गया है । उच्च मॉडल जीवों में, जैसे चूहों और Drosophila, axonal ट्रांसपोर्ट और IFT के व्यवधान अक्सर घातक phenotypes का कारण बनता है क्योंकि axonal ट्रांसपोर्ट और IFT जानवरों के morphogenesis और homeostasis के लिए जरूरी हैं , 11. चूहों के मामले में, सेल संस्कृति और अभिकर्मक आम तौर पर axonal परिवहन और IFT, जो कई कौशल और व्यापक समय12,13की आवश्यकता है निरीक्षण करने के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, महत्वपूर्ण शारीरिक संदर्भ का एक बहुत संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं और सेल लाइनों में खो सकता है । क्योंकि तंत्रिका तंत्र कीड़े के अस्तित्व के लिए आवश्यक नहीं है, सी. एलिगेंस म्यूटेंट जिसमें axonal परिवहन या IFT बाधित कर रहे हैं अक्सर घातक नहीं है7,9,14. Axonal परिवहन और IFT सीधे विच्छेदन के बिना vivo में मनाया जा सकता है क्योंकि सी. एलिगेंस पारदर्शी है और यह इसलिए GFP-टैग मार्करों का पालन करने के लिए आसान है ।

C. एलिगेंस, जैसे एक microfluidic डिवाइस15, संज्ञाहरण16, या microbeads17के साथ agarose पैड का उपयोग कर के रूप में स्थिर करने के लिए कई प्रोटोकॉल हैं । संज्ञाहरण के शामिल होने के ंयूरॉंस में तस्करी की घटनाओं को बाधित कर सकते है15। microfluidic-युक्ति विधि का एक स्पष्ट दोष यह है कि एक microfluidic डिवाइस की तैयारी हमेशा आसान नहीं है । इसके बजाय, agarose पैड और microbeads द्वारा स्थिरीकरण C. एलिगेंसमें समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक सुविधाजनक और आसान तरीका है । यहां, मैं सी. एलिगेंस में vivo में सी. एलिगेंस और टयूब axonal ट्रांसपोर्ट और IFT को मैटीरियल करने के लिए इस बुनियादी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं । अंय तरीकों की तुलना में, विधि यहां वर्णित विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और बहुत सस्ता है और प्रदर्शन करने के लिए आसान है ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. नमुना वडा

  1. उत्पन्न एक ट्रांसजेनिक C. एलिगेंस तनाव का उपयोग ट्रांसजेनिक के तरीके से करना < सुप class = "xref" > 18 . वैकल्पिक रूप से, Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर (CGC) से उपयुक्त उपभेदों प्राप्त करते हैं । synaptic पुटिका पुरोगामी के axonal परिवहन की कल्पना करने के लिए, ट्रांसजेनिक रेखा का उपयोग wyIs251 [ Pmig-13:: gfp:: ऄब-3 ] < सुप वर्ग = "xref" > 7 . IFT का निरीक्षण करने के लिए, ट्रांसजेनिक लाइन प्राप्त mnIs17 [ osm-6:: gfp ] < सुप वर्ग = "xref" > १९ . इन उपभेदों इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है ।
    नोट: या तो extrachromosomal सरणी, जीनोमिक एकीकरण, या यहां तक कि GFP दस्तक में काम करता है । पृष्ठभूमि संकेतों को कम करने के लिए, कक्ष-विशिष्ट प्रवर्तकों का उपयोग करें, बजाय पैन-न्यूरॉन प्रमोटरों.
    नोट: कीड़े का रखरखाव अन्य प्रोटोकॉल में वर्णित है < सुप क्लास = "xref" > 20 . उपभेदों निमेटोड विकास मध्यम (NGM) प्लेटों (१.७% (डब्ल्यू/वी) agarose पर Escherischia कोलाई OP50 फीडर के लॉन पर बनाए रखा गया था, 50mM NaCl, ०.२५% (w/v) peptone, 1 mm CaCl 2 , 5 मिलीग्राम/mL कोलेस्ट्रॉल, 25 mm KH 2 पो 4 , 1 mm MgSO 4 पर ६० एमएम व्यास प्लास्टिक व्यंजन) पर 20 & #176; ग.
  2. 20 पर कीड़े बढे ह & #176; ग NGM प्लेटों पर कीड़े के किसी भी जीवन चक्र चरण के लिए.
    नोट: एक दोनों axonal परिवहन और IFT किसी भी स्तर पर निरीक्षण कर सकते हैं । देर से L4 करने के लिए युवा वयस्क एक अच्छा सकारात्मक नियंत्रण है क्योंकि एकाधिक प्रकाशनों इन चरणों और visualized तस्करी घटनाओं का इस्तेमाल किया है < सुप वर्ग = "xref" > १४ , < सुप class = "xref" > 21 , < सुप class = "xref" > 22 , < सुप वर्ग = "xref" > 23 .
< p class = "jove_title" > 2. 10% Agarose को तैयार करना

< p class = "jove_content" > नोट: कई विक्रेता जैसे आगार, आगर पावडर, और Agarose जैसे उत्पाद उपलब्ध कराते हैं । फीमेल ट्रो ग्रेड agarose (जेल स्ट्रेंथ & #62; १२०० g/cm 2 ). सस्ते आगार चूर्ण काम नहीं करते क्योंकि परिणामस्वरूप जेल कीड़े को स्थिर करने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं है ।

  1. मिक्स ०.४ जी agarose में 4 मिलीलीटर आसुत जल (DW) एक ग्लास ट्यूब (१.५ सेमी x १०.५ सेमी) में । वाष्पीकरण से बचने के लिए ग्लास ट्यूब पर एक ढक्कन रखो ।
  2. ९० मिनट के लिए एक ९५ & #176; सी हीट ब्लॉक पर ग्लास ट्यूब डाल दिया । इसके अलावा, एक और ग्लास ट्यूब (१.५ cm x १०.५ cm) DW से भरा और इसे ९५ & #176 पर रख तैयार; c. एक पाश्चर प्लास्टिक को ९५ & #176; c DW (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 a ). छोटे बुलबुले का एक बहुत agarose ट्यूब में देखा जाएगा और समाधान पंकिल किया जाना चाहिए । इसे तब तक छोड़ दें जब तक समाधान स्पष्ट न हो जाए । फिर, ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण जब तक agarose समाधान सजातीय हो जाता है ।
    नोट: माइक्रोवेव जब DW और agarose से बनाया 10% agarose समाधान तैयार करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । माइक्रोवेव की वजह से छोटे बुलबुले agarose पिघलने को रोकते हैं । हालांकि, जम 10% agarose जेल आसानी से फिर से पिघला जा सकता है एक माइक्रोवेव का उपयोग कर । 10% agarose जेल से युक्त ग्लास ट्यूबों को समय से आगे तैयार किया जा सकता है और 4 & #176 से कम 6 महीने के लिए; C पर संग्रहित कर सकते हैं । यदि ऐसा करते हैं, एक माइक्रोवेव का उपयोग कर शेयर पिघल जब जरूरत है और इस प्रोटोकॉल में चरण 3 से शुरू करते हैं ।
    नोट: Agarose धीरे से अगर ९५ & #176 में एक लंबे समय के लिए या दोहराया solidification और पिघलने के बाद सी के लिए मशीन का जमना करने की क्षमता खो देता है । यदि ऐसा होता है, तो नए 10% agarose तैयार करें ।
< p class = "jove_title" > 3. Agarose पैड की तैयारी

  1. २.२ चरण में तैयार गर्म पाश्चर प्लास्टिक का उपयोग कर, एक ७६ x 22 मिमी स्लाइड पर 10% Agarose के 2 बूंदें जगह ।
  2. जल्दी से कवर एक दूसरे ७६ x 22 मिमी 2 स्लाइड से पहले agarose ड्रॉप जम के रूप में दिखाया < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 बी , और agarose समाधान समतल करने के लिए दूसरी स्लाइड पर नीचे पुश. मोटाई 0.5-1 मिमी होना चाहिए.
  3. जल्दी से पाश्चर पिपेट को फ्लश कर pipetting ९५ & #176; सी DW ऊपर और नीचे agarose समाधान जब तक बाहर धोया जाता है । अंयथा, प्लास्टिक agarose जेल से भरा हो जाएगा । छोड़ पिपेट में खड़े ९५ & #176; ग DW.
  4. 1 मिनट के लिए रुको । agarose पैड रूपों और बादल बन जाता है । फिर, स्लाइड को हाथ से अलग करें (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ C ).
< p class = "jove_title" > 4. कीड़े के बढ़ते

< p class = "jove_content" > नोट: कीड़ा आंदोलन की भी छोटी मात्रा अच्छा अवलोकन को रोकें । Levamisole परंपरागत रूप से agarose पैड पर कीड़ा आंदोलन को रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया है < सुप वर्ग = "xref" > 24 , < सुप क्लास = "xref" > 25 . हालांकि, Levamisole C. एलिगेंस में न्यूरॉन रिसेप्टर्स को रोकता है, और इसलिए न्यूरॉन्स में तस्करी की घटनाओं को प्रभावित कर सकते हैं < सुप वर्ग = "xref" > १५ . polystyrene microbeads का उपयोग करते हुए hereis एक अच्छा विकल्प < सुप वर्ग = "xref" > 17 .

एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत
  1. एक गिरावट दर्पण transillumination से सुसज्जित, स्थानांतरण ~ 30 ट्रांसजेनिक कीड़े एक प्लैटिनम तार लेने का उपयोग बैक्टीरिया के बिना एक नया NGM प्लेट के लिए उपयुक्त मार्करों व्यक्त.
    नोट: एक प्लैटिनम वायर उठाओ प्लैटिनम तार और पाश्चर पिपेट (5 इंच) से बना है, और प्लैटिनम तार की नोक समतल था । प्लैटिनम वायर की पसंद और इन के साथ कीड़े की हैंडलिंग की तैयारी Wormbook (http://www.wormbook.org) में वर्णित हैं ।
  2. 1 मिनट के लिए प्लेट छोड़ दें । बैक्टीरिया के बिना कीड़े NGM agarose जेल पर कदम के रूप में कीड़े की सतहों से स्वचालित रूप से हटा रहे हैं ।
  3. एक 0.5-1.0 & #181; एल ड्रॉप ऑफ २.६% १०० एनएम व्यास polystyrene microbeads पर पानी में आगर पैड (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 डी ) पर रखें । microbeads के लिए बैक्टीरिया मुक्त NGM प्लेट से 10-20 कीड़े स्थानांतरण । ड्रॉप और कीड़ा शरीर के अतिव्यापी से बचने के लिए प्लैटिनम तार लेने का उपयोग कर कीड़े फैल (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ E ).
  4. लागू a 22 x ४० mm 2 coverslip (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 च ). धीरे पुश हवा बुलबुले को दूर करने के लिए, लेकिन कीड़े को कुचलने से बचें । नमूना अब इमेजिंग के लिए तैयार है ।
    नोट: कोई संज्ञाहरण प्रशासित है क्योंकि, कीड़े केवल आगर पैड द्वारा उत्पन्न घर्षण बल द्वारा तय कर रहे हैं, polystyrene microbeads, और coverslip < सुप वर्ग = "xref" > १७ . फीडर बैक्टीरिया और/या बहुत अधिक समाधान की उपस्थिति घर्षण बल कमजोर कर देगा ।
    नोट: coverslips के विभिंन आकारों ( जैसे , 22 x 22 मिमी 2 , 18 x 18 मिमी 2 ) काम करते हैं । हालांकि, बड़ा coverslips निरीक्षण के दौरान नमूनों में लीक उद्देश्य लेंस से विसर्जन पानी या तेल को रोका जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 5. अवलोकन

< p class = "jove_content" > नोट: उपयुक्त इमेजिंग पैरामीटर (लेजर पावर, गेन, बिन्नी, आदि ) प्रत्येक माइक्रोस्कोप सिस्टम और कैमरे के लिए अलग होगा । यहां, एक widefield माइक्रोस्कोप एक कताई डिस्क फोकल स्कैनर और एक डिजिटल सीसीडी कैमरा के साथ सुसज्जित किया जाता है ।

  1. चरण का तापमान नियंत्रण सेट करने के लिए 20 & #176; सी, या कमरे के तापमान को समायोजित करने के लिए 20 & #176; c.
  2. ने नमूना स्लाइड को माइक्रोस्कोपी स्टेज पर रख दिया । का प्रयोग करें 100x (संख्यात्मक एपर्चर = १.३ या बेहतर) उद्देश्य लेंस ।
    3. < सुदृढ वर्ग में इंगित क्षेत्रों के लिए
  3. = "xfig" > आरेख 2 A (for wyIs251 and axonal मिती) or < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 B (for mnIs17 and IFT) के रूप में सकारात्मक नियंत्रण . अंय क्षेत्रों के रूप में अच्छी तरह से विश्लेषण किया जा सकता है < सुप वर्ग = "xref" > २२ .
  4. सेट पैरामीटर (सीसीडी लाभ = २००, बिन्नी = 1 या 2, लेजर पावर पर ४८८ एनएम = 1.0-1.3 मेगावाट) । 4 फ्रेम पर समय चूक रिकॉर्डिंग प्रदर्शन/mutli-TIFF स्वरूप के रूप में फ़ाइलों को सहेजने के लिए 1 मिनट ।
    नोट: यदि GFP संकेतों गायब हो और यह GFP का निरीक्षण करने के लिए जारी रखने के लिए मुश्किल है:: ऄब-3 या OSM-6:: GFP 30 एस के लिए, लेजर शक्ति भी मजबूत है । उस मामले में, लेजर शक्ति को कम । इसके विपरीत यदि कोई vesicular मूवमेंट दर्ज नहीं होता तो लेजर पावर भी कमजोर हो जाती है । उस स्थिति में, लेजर शक्ति बढ़ाएं ।
  5. एक अलग कीड़ा और दोहराने ५.३ और ५.४ का पालन करें । टिप्पणियों के लिए 20 मिनट के लिए पिछले कर सकते हैं, लेकिन प्रत्येक कीड़ा केवल एक बार दर्ज किया जाना चाहिए पी के प्रभाव से बचने के लिएहोटो नुकसान.
    नोट: कीड़े महत्वपूर्ण दोषों के बिना कम से कम 20 मिनट के लिए मनाया गया है < सुप क्लास = "xref" > 7 , < सुप क्लास = "xref" > 27 , < सुप क्लास = "xref" > 28 . अब अवलोकन संभव हो सकता है लेकिन हेवन & #39; टी अभी तक परीक्षण किया गया है । न्यूरॉन की मौत का एक स्पष्ट संकेत neurite सूजन के रूप में न्यूरॉन आकृति विज्ञान के परिवर्तन है । के रूप में कमजोर GFP संकेतों दोनों wyIs251 और mnIs17 में axons और dendrites में देखा जा सकता है, neurite आकृति विज्ञान बस axons या dendrites देख कर आसानी से जांच की जा सकती है । न्यूरॉन आकृति विज्ञान में दिखाया गया है < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा २ .
  6. चलचित्र फ़ाइलें जनरेट करें ।
    1. फिजी सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर बहु-TIFF फ़ाइल खोलें । File & #62 पर जाएं; खोलें तब चरण ५.४ में सहेजी गई बहु-TIFF फ़ाइल का चयन करें ।
      नोट: फिजी jttps://fiji.sc पर डाउनलोड किया जा सकता है । छवि जंमू और plugins भी kymographs उत्पंन किया जा सकता है । यदि ऐसा करते हैं, तो चुने गए प्लगइन के लिए प्रासंगिक निर्देशों का पालन करें । & #160;
    2. क्लिक करें & #34; आयताकार चयन & #34; बटन (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 एक , तीर) और एक आयत ड्राइंग द्वारा ब्याज के क्षेत्र का चयन करें एक कंप्यूटर माउस के साथ (< सबल वर्ग में पीला आयत = "xfig" > चित्रा ३ a ). Go Image & #62; पोट & #62; tools & #62; उपस्टैक्स बनाएं और चलचित्र में शामिल स्लाइस संख्याओं का चयन करें । कोई उपस्टैक जनरेट किया गया है ।
    3. क्लिक करके उपस्टैक विंडो सक्रिय करें और छवि & #62 पर जाएं; समायोजित & #62; चमक/कंट्रास्ट । चमक और कंट्रास्ट को समायोजित करने के लिए एक विंडो दिखाता है । खिड़की में, शीर्ष पट्टी स्लाइड (सही करने के लिए ंयूनतम) ताकि पृष्ठभूमि संकेत गायब हो जाता है और दूसरी शीर्ष बार (अधिकतम) बाईं ओर इतना है कि चलती बुलबुले और कणों पृष्ठभूमि पर काफी अच्छी तरह से देखा जा सकता है ।
    4. Go on Image & #62; पोट & #62; टाइम स्टैम्पर. के रूप में फिल्म 4 फ्रेंस में दर्ज किया गया है/५.४ चरण में, समय अंतराल ०.२५ s है । इस प्रकार, अंतराल में & #34; ०.२५ & #34;
    5. फ़ाइल मेनू (चलचित्र 1 और 2) से सहेजें के रूप में & #62; AVI का चयन करके एक चलचित्र फ़ाइल जनरेट करें ।
      नोट: उपयुक्त plugins का उपयोग करके, आप फ़ाइल को अंय स्वरूपों जैसे & #34; mpeg4 & #34; या & #34; mov & #34; files.
      6. के रूप में सहेज सकते हैं ।
  7. उत्पन्न kymographs.
    1. फिजी सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर मूल मूवी फ़ाइलें फिर से खोलें और चरण 5.6.2 और 5.6.3 चमक और कंट्रास्ट समायोजित करने के लिए दोहराएँ ।
    2. Click & #34; फॉल्ट लाइन & #34; (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 B , arrow). माउस का उपयोग करके, cilia या axon (पीली रेखा, < सशक्त वर्ग में) के साथ एक विभाजित रेखा आरेखित करें = "xfig" > आरेख 3 B ).
    3. गो श्लेष & #62; बहु Kymograph & #62; बहु Kymograph (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ग ). पंक्ति चौड़ाई विंडो प्रकट होती है (< सशक्त वर्ग = "xfig" > आरेख 3 D ). प्रकार & #34; 3 & #34; Linewidth विंडो में क्लिक करें और ok (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 D ).
    4. Kymograph विंडो बनाई गई है । TIFF या JPEG स्वरूप में छवि सहेजें ।

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Representative Results

DA9 न्यूरॉन में Axonal परिवहन
wyIs251 लाइन का प्रयोग, GFP के anterograde और प्रतिगामी axonal परिवहन दोनों:: ऄब-3 एक साथ DA9 मोटर ंयूरॉन में दर्ज किया जा सकता है । DA9 ंयूरॉन के समीपस्थ पृष्ठीय axon में anterograde और प्रतिगामी परिवहन की औसत गति के बारे में १.८ और २.६ माइक्रोन/ बढ़ते बुलबुले की संख्या के बारे में है ०.०३ और ०.०१८ प्रति axon की माइक्रोन प्रति । इस प्रकार, एक DA9 axon के 10 माइक्रोन के एक 30 एस अवलोकन के लिए एक 100x लेंस का उपयोग कर, एक के बारे में 9 और 5 axon में बुलबुले घूम पा सकते है (चित्रा 4 और फिल्म 1) । यदि कोई vesicular आंदोलन नहीं मनाया जा सकता है, यह संभव है कि लेजर शक्ति भी कमजोर है । लंबी दूरी के रन के अलावा, पुटिका पूल के लघु रेंज आंदोलन (फिल्म 1) दर्ज किया जा सकता है । कुछ बुलबुले इन पुटिका पूल में बंद है, जबकि दूसरों को वहां से अलग7,23। इन मापदंडों पर नजर रखी जा सकता है और उत्परिवर्ती phenotypes का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया ।

पूंछ न्यूरॉन्स में IFT
Cilia सी. एलिगेंस (चित्रा 2बी) में dendrites की नोक को स्थानीयकृत कर रहे हैं । mnIs17 तनाव GFP-टैग OSM-6, IFT उपइकाईयों में से एक29। OSM-6 दोनों सिर और पूंछ ंयूरॉंस19में व्यक्त की है । जबकि कई सिर cilia mnIs17द्वारा लेबल कर रहे हैं, केवल दो cilia स्पष्ट रूप से पूंछ ंयूरॉन में मनाया जाता है । इस प्रकार, इन cilia देख सिर cilia से आसान है (भी चर्चा देखें) । OSM-6:: GFP न्यूरॉन कोशिका में फैलाना है जैसे कि axon, कोशिका शरीर में पाया, और dendrite. हालांकि, cilia में, OSM-6:: GFP cilia और चलती कणों में शामिल करने के लिए केंद्रित है । के ्ह् और PHB cilia की लम्बाई लगभग ६.५ माइक्रोन हैं. Anterograde IFT का biphasic 8,9है । anterograde IFT की गति लगभग ०.७ है और cilia के मध्य और बाहर के खंडों में १.३ माइक्रोन/क्रमशः (चित्र 5 और चलचित्र 2) ।

Figure 1
चित्र 1 : नमूना तैयारी का प्रदर्शन. (क) गर्म DW, पाश्चर प्लास्टिक और हीट ब्लॉक पर 10% agarose । (B और C) agarose पैड की तैयारी: एक agarose पैड स्लाइड (B) के बीच बनाई गई है । agarose पैड प्रपत्रों (C) के बाद ऊपरी स्लाइड निकाल दी जाती है । (घ) योजनाबद्ध ड्राइंग कैसे polystyrene मनका समाधान दिखा रहा है agarose पैड पर डाल दिया है । (E) योजनाबद्ध दिखाने कैसे कीड़े polystyrene मनका एक प्लेटिनम तार लेने के समाधान का उपयोग कर में डाल रहे है ड्राइंग । (च) एक coverslip (२२ x ४४ मि. मी.२) agarose पैड पर लगा है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : इमेजिंग क्षेत्र. (क) DA9 और VA12 न्यूरॉन्स के योजनाबद्ध ड्राइंग और wyIs251की एक प्रतिनिधि छवि. DA9 न्यूरॉन्स में, ventral axon, संयोजिका, और समीपस्थ axon परिपक्व synapses नहीं है. लेकिन synaptic पुटिका के प्रणेता इन axonal क्षेत्रों के जरिए कोशिका शरीर से synapses तक पहुँचाया जाता है. इस क्षेत्र को देखा जाना चाहिए बक्से द्वारा दिखाया गया है । (ख) के ्ह् और PHB न्यूरॉन्स और उनके cilia की योजनाबद्ध ड्राइंग. इस क्षेत्र को देखा जाना चाहिए बक्से द्वारा दिखाया गया है । स्केल बार = 10 माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : फिल्मों और फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर kymographs का उत्पादन । (A) "आयताकार चयन" बटन (तीर) पर क्लिक करें और क्षेत्र का चयन एक एक आयत (पीला बॉक्स) के लिए उपस्टैक उत्पंन ड्राइंग द्वारा पर ध्यान केंद्रित करना चाहते हैं । (B) सेगमेंट्ड लाइन बटन (तीर) पर क्लिक करें और माउस (पीली रेखा) का उपयोग करके cilia के साथ एक सेगमेंट की रेखा बनाएं । (ग) का चयन करें "विश्लेषण", "मल्टी Kymograph", और "मल्टी Kymograph" kymographs उत्पंन करने के लिए एक प्लगइन शुरू करने के लिए । (S) इनपुट linewidth, क्लिक करें "OK" और उत्पंन kymographs (चित्रा 5 और चित्रा 7) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : axonal ट्रांसपोर्ट ऑफ synaptic पुटिका पुरोगामी के प्रतिनिधि kymograph. GFP:: ऄब 3 आंदोलन DA9 ंयूरॉन के समीपस्थ asynaptic क्षेत्र में मनाया जाता है और kymograph फिजी के बहु kymograph के साथ उत्पंन किया गया था । क्षैतिज और अनुलंब पट्टियां क्रमशः लंबाई और समय दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : IFT के प्रतिनिधि kymograph. OSM-6:: GFP के ्ह् और PHB cilia में मनाया जाता है और यह kymograph इनमें से किसी एक में तस्करी की घटना से उत्पन्न होता है. फिजी की बहु kymograph के साथ kymograph उत्पन्न हुई । क्षैतिज और अनुलंब पट्टियां क्रमशः लंबाई और समय दर्शाती हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Movie 1
movie 1: synaptic पुटिका पुरोगामी की axonal ट्रांसपोर्ट की प्रतिनिधि मूवी । GFP:: ऄब-3 आंदोलन DA9 ंयूरॉन के समीपस्थ asynaptic क्षेत्र में मनाया जाता है । GFP:: ऄब-3 को synaptic पुटिका पुरोगामी और उत्पात में शामिल किया गया है । anterograde और प्रतिगामी axonal परिवहन दोनों दर्ज हैं । कुछ बुलबुले बंद करो लेकिन फिर से पुनः आरंभ । फिल्म 4 फ्रेम में दर्ज किया गया था/s और 15 फ्रेंस में नाटकों/Scale बार = 5 माइक्रोन । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

Movie 2
मूवी 2: IFT के प्रतिनिधि मूवी । OSM-6:: GFP के ्ह् और PHB cilia में मनाया जाता है । OSM-6:: GFP IFT परिसर में शामिल है और cilia के साथ चलता है । फिल्म 4 फ्रेम में दर्ज किया गया था/s और 15 फ्रेंस में खेलता है = 5 माइक्रोन बार । इस वीडियो को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

मौजूदा तरीकों के संबंध में सीमा
विधि यहां वर्णित axonal परिवहन और IFT जैसे तेजी से घटनाओं का पालन करने के लिए अनुकूलित है । इस प्रकार, स्थिरीकरण अधिक अब गर्मी से प्राथमिकता है । जब तक हम महत्वपूर्ण गड़बड़ी के बिना कम से 20 मिनट के लिए तस्करी की घटनाओं का निरीक्षण करने में सक्षम है, इस विधि हमेशा अब टिप्पणियों की आवश्यकता होती है धीमी घटनाओं का पालन करने के लिए उपयुक्त नहीं हो सकता है, जैसे axon बढ़ाव और सेल माइग्रेशन. अब टिप्पणियों के लिए, एक agarose के प्रतिशत को कम करने (यानी, पानी को सुखाने से बचने के लिए और दबाव है कि संभावित रूप से नुकसान का कारण कम करने के द्वारा शर्तों का अनुकूलन की जरूरत है) । वैकल्पिक रूप से, microfluidic डिवाइस agarose पैड और संज्ञाहरण का उपयोग कर कीड़े के15 या स्थिरीकरण ऊपर वर्णित16 अधिक उपयुक्त हो सकता है, जबकि साइड इफेक्ट ध्यान से मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण चरणों
पर्याप्त अवलोकन के लिए, मार्कर महत्वपूर्ण हैं । मार्करों को बुलबुले या कणों में शामिल किया जा सकता है और पर्याप्त चमक की जरूरत है । या तो extrachromosomal arrays या एकीकृत लाइनों का इस्तेमाल किया जा सकता है । DA9 ंयूरॉंस में synaptic पुटिका अग्रदूतों के axonal परिवहन के दृश्य के लिए, wyIs251 तनाव उपयोगी7,23है । jsIs821 के कुछ अध्ययनों में26,27में mechanosensory न्यूरॉन्स में axonal परिवहन का पालन किया गया है. जब अंय ंयूरॉंस विश्लेषण कर रहे हैं, synaptic पुटिका प्रोटीन रुचि सेल विशिष्ट प्रवर्तकों का उपयोग ंयूरॉंस में व्यक्त किया जाना चाहिए । इन प्रवर्तकों को काफी मजबूत होना चाहिए । ऄब-3 और SNB-1 को synaptic पुटिका के पुरोगामी22,23,26के लैबल पर व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है । IFT का निरीक्षण करने के लिए, IFT परिसर के घटकों को चिह्नित किया जाना चाहिए । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, mnIs17 तनाव एक अच्छा विकल्प29है । 8 कोशिकाओं से निर्गत Cilia (, एएसजी, एएसआई, ASL, ऐश, पूछो, एडीएफ, और ADL) सिर में एक साथ बंडल है (amphid) जबकि 2 कोशिकाओं से Cilia (्ह् और PHB) पूंछ (phasmid) में बंडल हैं । क्योंकि OSM-6:: GFP में सभी oleraceum न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है, यह सिर IFT में विस्तार से cilia का विश्लेषण करने के लिए मुश्किल हो सकता है । हालांकि, टेल रीजन में केवल ्ह् और PHB न्यूरॉन्स को लेबल किया गया है और हर सेल में IFT आसानी से सुलझाया जा सकता है. अंय IFT प्रोटीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा लेबल के लिए IFT21,28निरीक्षण किया जा सकता है । यदि एक के लिए सिर ंयूरॉंस का विश्लेषण करना चाहता है, सेल विशिष्ट प्रमोटरों उपयोगी होगा । जबकि हैड cilia में बदलती morphologies हैं, परिवहन की घटनाओं को29दर्ज किया जा सकता है । इन मार्करों के साथ म्यूटेंट पार करके, axonal परिवहन और IFT में किसी भी जीन का कार्य vivo मेंविश्लेषण किया जा सकता है । विश्लेषण किया जा सकता है जो पैरामीटर्स पिछले कार्य में22,23,26,27बताए गए हैं । GFP सबसे अच्छा और प्राथमिक विकल्प है । mCherry और tdTomato भी22इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि, mCherry GFP से ज्यादा dimmer है । tdTomato एक मिलकर डिमर और monomeric फ्लोरोसेंट प्रोटीन है, जो कभी-कभार फ्यूजन प्रोटीन की गतिशीलता को प्रभावित करता है की तुलना में बड़ा है30। इसलिए, परिणामों का विश्लेषण किया जाना चाहिए और सावधानी से व्याख्या की जब tdTomato प्रयोग किया जाता है । mScarlet, एक चमकदार monomeric लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन है जो हाल ही में विकसित किया गया है, एक वैकल्पिक विकल्प31है ।

जबकि कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप व्यापक रूप से axonal परिवहन और IFT7,21का पालन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, उपकरण महंगा है और कुछ शोध के वातावरण में उपयोग करने के लिए मुश्किल हो सकता है । हालांकि, इन घटनाओं को भी दर्ज किया जा सकता है और सी. एलिगेंस में विश्लेषण मानक फ्लोरोसेंट सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर, अगर उच्च ना लेंस से सुसज्जित है, क्योंकि सी एलिगेंस एक छोटे और पारदर्शी जानवर और निरीक्षण करने के लिए आसान है ।

भविष्य आवेदन
इसी तरह के स्थिरीकरण विधि द्वारा यहां वर्णित, IFT vivo३२में एकल अणु संकल्प पर मनाया गया । इसके अलावा, सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के कई प्रकार विकसित किया गया है । एक सीधे सुपर संकल्प सूक्ष्म विश्लेषण करने के लिए यहां वर्णित तरीकों को लागू कर सकते हैं । मेरे अनुभव में, Airyscan३३ के तेजी से मोड काम करता है बहुत अच्छी तरह से IFT विश्लेषण । सैद्धांतिक रूप से, एक स्पिनिंग डिस्क सुपर संकल्प माइक्रोस्कोप (SDSRM) एक अच्छा विकल्प के रूप में अच्छी तरह से३४होगा । अंत में, उत्परिवर्ती पुस्तकालयों और इन नई तकनीकों के संयोजन से, यहां वर्णित विधि axonal परिवहन और vivo मेंIFT के आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी होना चाहिए ।

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Disclosures

लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक गहराई से धंयवाद डॉ Asako Sugimoto (उसके सहायक चर्चा के लिए Tohoku विश्वविद्यालय) । wyIs251 डॉ कांग शेन (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) से एक उदार उपहार था । mnIs17 CGC द्वारा प्रदान किया गया था, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है. इस काम को JSPS KAKENHI ग्रांट #17H05010 और #16H06536 और डायची Sankyo फाउंडेशन, ब्रेन साइंस फाउंडेशन और नैतो फाउंडेशन ने सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slideglass (76  x 26 mm) Matsunami S1111
Coverglass (22  x 40 mm) Matsunami C024401
Agarose Wako 318-01195
Polystylene microbeads 0.1 micron Polysciences #00876
Heat block TAITEC 0063288-000 CTU-mini
Microscope Olympus IX-71 widefield microscope
Spinning disk Scanner Yokogawa CSU-X1 spinning disc confocal scanner 
Digital CCD camera Hamamatsu Photonics C10600-10B ORCA-R2 degital CCD camera
Objective lens (x100, NA1.4) Olympus UPLSAPO 100XO
Pasteur pipette (5 inch) IWAKI IK-PAS-5P
Glass tube (1.5 cm diameter x 10.5 cm) IWAKI 9820TST15-105NP
TV9211: wyIs251 Laboratory of Kang Shen N/A
OTL11: mnIs17 Ref. 27, 29 N/A SP2101 was backcrossed with wild type for 6 times
Stereo microscope Carl Zeiss 435064-9000-000 STEMI 508 
Mirror transillumination unit Carl Zeiss 435425-9010-000
platinum wire (0.2 mm) Nilaco Corporation m78483501
60 mm plastic dish Falcon #351007
Fiji N/A N/A https://fiji.sc/
nematode growth medium (NGM)   1.7% (w/v) agarose, 50mM NaCl, 0.25% (w/v) Peptone, 1 mM CaCl2, 5 mg/mL Cholesterol, 25 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4 

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक १२८ Axonal परिवहन Intraflagellar परिवहन Caenorhabditis एलिगेंस माइक्रोस्कोपी न्यूरॉन cilia
न्यूरॉन्स में Intracellular परिवहन का विश्लेषण करने के लिए <em>Caenorhabditis एलिगेंस</em> के स्थिरीकरण
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Niwa, S. Immobilization of… More

Niwa, S. Immobilization of Caenorhabditis elegans to Analyze Intracellular Transport in Neurons. J. Vis. Exp. (128), e56690, doi:10.3791/56690 (2017).

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