Questo protocollo descrive un sistema di espressione di proteina indotta da scossa di calore (sistema pDHsp/V5-His/sf9 cellulare), che può essere utilizzato per esprimere proteine straniere o per valutare l'attività anti-apoptotica di potenziali proteine straniere e loro troncato amminico acidi in cellule di insetto.
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Articolo metodologico
Espressione transiente di geni estranei in cellule di insetto (sf9) per analisi funzionale della proteina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il sistema di espressione genica transitoria è una delle tecnologie più importanti per l'esecuzione di analisi funzionale della proteina in baculovirus in vitro sistema di coltura cellulare. Questo sistema è stato sviluppato per esprimere stranieri geni sotto il controllo del promotore baculovirus in plasmidi di espressione transiente. Inoltre, questo sistema può essere applicato a un'analisi funzionale del baculovirus sé o proteine straniere. Il sistema di espressione genica transitoria più ampiamente e commercialmente disponibile è sviluppato sul promotore del gene immediati-presto (IE) di Orgyia pseudotsugata virus nucleopolyhedrovirus (OpMNPV). Tuttavia, è stato osservato un livello basso di espressione di geni estranei in cellule di insetto. Di conseguenza, un sistema di espressione genica transitoria è stato costruito per migliorare l'espressione della proteina. In questo sistema, plasmidi ricombinanti sono stati costruiti per contenere la sequenza di destinazione sotto il controllo del promotore (Dhsp70) 70 di Drosophila calore shock. Questo protocollo presenta l'applicazione di questo calore shock-base pDHsp/V5-His (epitopo V5 con 6 istidina) /Spodoptera frugiperda cell sistema (sf9 cella); Questo sistema è disponibile non solo per l'espressione genica ma anche per valutare l'attività anti-apoptotica di candidato proteine in cellule di insetto. Inoltre, questo sistema può essere sia transfected con un plasmide ricombinante o co-trasfettate due plasmidi ricombinanti potenzialmente funzionalmente antagonistiche in cellule di insetto. Il protocollo dimostra l'efficienza di questo sistema e fornisce un caso pratico di questa tecnica.
Introduzione
Due sistemi di espressione della proteina sono stati comunemente utilizzati per la produzione di proteine: sistemi di espressione proteica prokaryote (sistema di espressione del gene diEscherichia coli ) e sistemi di espressione della proteina dell'eucariota. Un sistema di espressione della proteina eucariote popolare è il baculovirus espressione vettoriale sistema (BEVS)1. Baculoviridae in primo luogo sono stati usati come agenti di controllo biologico in tutto il mondo dell'agricoltura e della foresta di parassiti. Negli ultimi decenni, Baculoviridae sono stati sviluppati come strumenti biotecnologici per vettori di espressione di pr....
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Protocollo
1. preparati
- Coltura delle cellule dell'insetto
- Preparare 50 mL di mezzo di coltura cellulare. A tale scopo, aggiungere 500 µ l di antibiotici (anfotericina B = 0,25 µ g/mL, penicillina = 100 unità/mL, streptomicina = 100 µ g/mL) e 5 mL di siero bovino fetale inattivati al calore nel mezzo di coltura privo di siero cellulare (senza FBS o antibiotici).
Nota: Riscaldare il siero bovino fetale a 65 ° C per 30 min in un bagno di acqua prima dell'uso. - Mantenere Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), cellule di insetto sf9. Staccare ca. 80% delle cellule dal matraccio di cultura di 25cm2 cella agi....
- Preparare 50 mL di mezzo di coltura cellulare. A tale scopo, aggiungere 500 µ l di antibiotici (anfotericina B = 0,25 µ g/mL, penicillina = 100 unità/mL, streptomicina = 100 µ g/mL) e 5 mL di siero bovino fetale inattivati al calore nel mezzo di coltura privo di siero cellulare (senza FBS o antibiotici).
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Risultati
L'intera lunghezza e altri due troncamenti (domini BIR e anello) di Ly-IAP3 da LyxyMNPV overexpressed in cellule sf9, basato sul calore shock-base pDHsp/V5-His /Spodoptera frugiperda (sf9 cella) sistema di celle. Il pDHsp/V5-His conteneva un promotore di un proteina di scossa calore di Drosophila , che aziona l'espressione genica a valle ad una temperatura di 42 ° C condizione utilizzando fattori trascrizionali cellulari e la traduzione del sistema (.......
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Discussione
Il concetto di sistema basati su shock cellulare pDHsp/V5-His/sf9 calore era in primo luogo descritto da Clem et nel 19948. Confronto del promotore del gene di baculovirus (IE1) e Drosophila hsp70 ha mostrato che quel hsp70 aveva una maggiore efficienza nella zanzara cellule10. Inoltre, a causa dell'induzione di scossa di calore, la tempistica dell'espressione della proteina potrebbe essere controllata precisamente dopo trattamento di sho.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Si ringrazia il Dr. Jian-Horng Leu dell'Istituto di Biologia Marina, National Taiwan Ocean University per la fornitura di 3 costruzioni di plasmide. Questa ricerca è stata sostenuta da Grant 106-2311-B-197-001 - dal Ministero della scienza e della tecnologia (MOST).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Antibiotico-Antimicotico, 100X | Gibco | 15240-062 | per coltura cellulare di insetti |
| Siero bovino fetale certificato | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | terreno di coltura cellulare privo di siero |
| Cellule Sf9 ATCC | CRL-1711 | ||
| Pallone per coltura cellulare da 25 cm2 | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Microscopia ottica invertita | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Brodo (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, grado batteriologico | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selezione antibiotico |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (senza endotossine) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning Provette da centrifuga da 50 mL | SIGMA | CLS430829-500EA Provette | 50 mL |
| Emocitometro | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| multipiatto a 24 pozzetti | , Thermo Fisher | 142475 | piastra a 24 pozzetti |
| Reagente Cellfectin II | Reagente per transfectina cellulare | Thermo Fisher | |
| 10362100 PBS-Phosphate-Buffered Soluzione salina (10X) pH 7,4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4&volte; Colorante di caricamento SDS | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (membrane assorbenti PVDF) | Membrane Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF |
| Sistema di celle Mini Trans-Blot | BIO-RED | 1703930 Dispositivo di blotting | |
| Ponceau S | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | anticorpo |
| anti-V5 di coniglioCapra anti-coniglio IgG-rafano perossidasi (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0,4 % soluzione di tripano blu | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipettatore | Gilson F144802 | ||
| P1000 pipettatore | Gilson | ||
| Nastro | Symbio | PPS7 | Nastro a 24 pozzetti ( 19 mm&volte; 36 M) |
Riferimenti
- Miller, L. K. Baculoviruses as gene expression vectors. Annual Reviews in Microbiology. 42 (1), 177-199 (1988).
- Theilmann, D. A., et al. Family Baculoviridae. Virus Taxonomy: Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Fauquet, C. M., M....
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Ristampe e permessi
