경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 Intramyocardial 주입 및 큰 전 임상 모델에서 셀 배달

Summary

심장 재생 의학에 새로운 치료 전략 인 간에 있는 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 전에 큰 전 임상 동물 모델에서 광범위 하 고 상세한 연구를 요구 한다. 여기, 우리는 같은 소설 치료의 효능을 시험 하는 가설에 대 한 귀중 한 토끼, 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 기술을 보여줍니다.

Abstract

세포 및 유전자 치료는 흥분 하 고 심장 마비와의 설정에서 심장 재생을 위해 유망 전략 감소 방출 분수 (HFrEF). 전에 그들은 사용을 위해 고려 하 고 인간에서 구현 수, 광범위 한 임상 연구 필요 큰 동물 모델에서 안전, 효능, 심근에 전달 한 번 injectate (예를들면, 줄기 세포)의 운명을 평가 합니다. 작은 설치류 모델 제공 장점 (예를 들어, 비용 효율성, 유전자 조작에 대 한 순종); 그러나, 이러한 연구 결과 거의 진료소로 변환 이러한 모델의 한계를 감안할 때. 반대로, 토끼, 동물 모델을 큰 장점 (예, 인간 및 다른 큰 동물에 비해 비슷한 심장 전기 생리학), 있다 좋은 비용 효율적인 균형을 유지 하는 동안. 여기는 경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 intramyocardial 주입 (IMI) 기술, 최소 침 습, 안전 하 고, 잘 용납 하 고 셀을 포함 하 여 injectates의 대상된 배달에 매우 효과적인 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 토끼 모델의 심근 내에서 여러 위치에 이 기술 구현 하기 위한 우리 또한 널리 임상 심장 초음파 시스템의 장점을 촬영 했습니다. 두기 후에 연습에서 여기에 설명 된 프로토콜, 기본 초음파 기술 연구원 실험, 가설의 목적에서 일상적인 사용을 위한이 다양 하 고 최소한 침략 적 기법의 성능에 유능한 될 것 이다는 토끼 모델에서 심장 재생 치료제의 기능. 역량을 달성 하 고, 일단 모든 절차 토끼 anaesthetizing 후 25 분 내에서 수행할 수 있습니다.

Introduction

세포 및 유전자 치료 흥미로운 고도 HFrEF에 부상된 심근 재생/수리에 대 한 전략을 개발. 몇 가지 연구는 지속적으로 intracoronary 또는 정 맥 경로^1,2 이상의 IMI의 우수성을 증명 하고있다 셀 배달의 다른 노선의 효과 (예를 들어, 셀 유지 비율)을 비교 ^{, 3 , 4 , 5}. 따라서, 그것은 놀라운 부상된 심근의 줄기 세포 치료의 변환 모델에 대 한 연구의 큰 비율 IMI는 오픈 가슴 절차^{6,7에서에서 직접 보기 아래 수행을 통해 injectate 제공} . 그러나,이 접근 peri 절차 사망률 (자주 아래 보고)⁸의 위험을 운반 절차의 침략 적인 본질을 포함 한 몇 가지 제한이 있다. 또한, 직접 보기 아래 IMI는 심 실 구멍에 실수로 주입에 대 한 가능성을 제거 하지 않습니다. 임상 연습에서 오픈 가슴 수술 동안 IMI 치료 세포 배달, 예를 들어에 대 한 적절 한 방법이 될 수, 동안 관상동맥 우회 이식 수술 (관상); 그러나,이 방법은 않을 수 있습니다 셀 배달에 대 한 적절 한 비-허 혈 성 근원 (예를 들어, HFrEF 안트라사이클린 유발 심근 (AICM)을 보조)의 글로벌 심근에.

의심의 여지가 그 허 혈 성 심장 질환 (IHD)는 HFrEF의 가장 일반적인 원인입니다 (~ 66%)^9,10; 그러나, AICM를 포함 하 여 비-허 혈 성 심근 여전히 영향을 미치는 환자 HFrEF (33%)⁹ 의 상당 비율을 차지 . 실제로, 임상 종양학의 최근 발전 귀착되 유럽, 암 환자^{12의 향상 된 생존에 대 한 전반적인 트렌드와 비슷한 숫자의 견적 미국 혼자11, 암 10 백만 이상의 생존자 ,13}. 따라서, 환자 수가 증가 주어진와 같은 줄기 세포 이식 줄기 세포 전달의 효과적이 고 최소 침 습 루트의 시험 뿐 아니라 비-허 혈 성 심장 근육 병 증에 대 한 최대 중요성은 소설 치료의 혜택을 탐험, cardiotoxicity 보조 항 암 약물에 의해 영향을 받습니다.

노트, 가설 연구 부상된 심근을 자주으로 수리 재생성을 목표로 줄기 세포 치료를 사용 하 여 테스트 (예:마우스, 쥐) 작은 설치류의 사용을 포함. 이러한 모델 종종 일반적으로 일부 연결된 한계 (예를 들면, 반향)¹⁴있는 선형 배열 트랜스듀서를 장착 하는 심근 기능의 평가 위한 비싼 높은 주파수 초음파 시스템을 필요로 합니다. 그러나, 토끼, 대표 하는 대형 전 임상 모델을 다른 모델 HFrEF에서 줄기 세포 치료의 가설에 대 한 몇 가지 장점이 있다. 따라서, 쥐 및 쥐, 달리 토끼 유지 Ca^{+ 2} 교통 시스템 및 인간과 기타 큰 동물 (예:개, 돼지)^{15,16,17의 유사한 세포 생리학 ,,1819}. 또 다른 장점은, 심장 초음파 이미징 사용 하 여 상대적으로 저렴 한과 널리 임상 심장 초음파 시스템 상대적으로 높은 주파수 위상 배열 트랜스듀서, 예를 들면, 12mhz와 같은 대 한 그들의 순종은 그 신생아 및 소아 심장에서 자주 사용 됩니다. 이러한 시스템 첨단 기술, 우수한 echocardiographic 이미징 허용 하 고 그들은 고조파 이미징²⁰의 우월의 활용. 또한,에 배달 심장 재생 요법 (예를 들어, 줄기 세포 치료)의 잠재력, 그들의 안전, 효능, cardiomyogenic 잠재력으로 평가 injectate의 운명의 한 번의 광범위 한 가설에 심근, 인간의 사용에 대 한 간주 될 수 있습니다 그리고 그들은 큰 전 임상 동물 모델, 토끼^17,19의 사용을 필요로 하기 전에 필수입니다. 여기, 우리는 줄기 세포 이식에 기초를 둔 치료 비-허 혈 성 심근^{20 대를 겨냥 하는 임상 심장 초음파 시스템을 사용 하 여 경 피 적인 대비-심장 초음파 유도 IMI 통해 셀 배달에 대 한 최소 침 습 기술을 설명합니다} . 우리는 또한 토끼 심장에 injectate의 한 초음파 대비 에이전트와 제자리에서 추적으로 인도 잉크 (InI, 또한으로 알려진 중국 잉크)의 혜택을 설명합니다.

Protocol

여기에 설명 된 실험 대학 무르시아, 스페인의 윤리 연구 위원회에 의해 승인 했다 고 유럽 연합 지침 2010/63/유럽 위원회의에 따라 수행 했다. 설명 하는 단계는 작업의 계획의 일부를 전적으로이 종이 동반 비디오 촬영을 위해 수행 되지 표준 작동 프로토콜에서 수행 했다. 1. 셀과 포유류 표정 벡터의 준비 참고: 여기, 우리가 간략하게 설명 준비 및 셀 선 (?…

Representative Results

경 피 적인 대비 심장 초음파-가이드 IMI InI: 위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 고 바늘의 팁의 최적의 위치는 심장 초음파와 시작 하는 주입에 의해 확인 되었다, 일단 과거 hyperechogenicity InI의 전달 중 관찰 되었다 (PBS에 10 %v / v) (그림 2E) 대상 지역 (그림 2F) IMI 뿐만 조?…

Discussion

기본 목표는의 사용을 활용 하는 동안 토끼 (대형 크기의 전 임상 동물 모델)^17,18, 심근으로 줄기 세포의 배달을 위해 사용 될 수 있는 최소 침 습 기술을 개발 하는 상대적으로 저렴 한 이미징 시스템을 쉽게 사용할 수 많은 임상 연구 센터. 여기, 우리 임상 심장 초음파 시스템을 사용 하 여, 표시 하 고 InI, 추적 기능 제자리에 와 echogenic 속성, 심?…

Materials

HD11 XE Ultrasound System	Philips	10670267	Echocardiography system.
S12-4	Philips	B01YgG	4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)	Parket laboratories Inc	N 01-08
Vasovet 24G	Braun	REF 381212	over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe	Braun	9161406V
Imalgene (Ketamine)	Merial	RN 9767	Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine)	Esteve	CN 570686.3	Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1	Faber-Castel	16 33 99	India (China) Ink
Holter Syneflash	Ela medical	SF0003044S	24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor®	Ambu (NUMED)	VLC-00-S	Holter ECG electrodes.
Microtome	Leica Biosystems	RM2155
Microscope	Olimpus	CO11
ABC Vector Elite	Vector Laboratories	PK-6200	Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262	Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-9010	Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	DAKO (Agilent)	S3000
Fluorescence Microscope	Carl Zeiss MicroImaging	Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG	Elamedical	Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Fisher Scientific	11965084
10% fetal calf serum (FCS)	Fisher Scientific	11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)	Fisher Scientific	11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM)	Fisher Scientific	31985070
Hygromycin B	Calbiochem (MERCK)	400051
Xylene (histological)	Fisher Scientific	X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)	Sigma	H1009
Pronase	Fisher Scientific	53-702-250KU