PCI kontrast Echocardiography-guidede Intramyocardial injeksjon og celle levering i en stor prekliniske modell

Summary

Romanen strategier i cardiac regenerativ medisin krever omfattende og detaljerte studier i store prekliniske dyremodeller før de kan bli vurdert for bruk i mennesker. Her viser vi en PCI kontrast echocardiography-guidede intramyocardial injeksjon teknikk i kaniner, som er nyttig for hypotesetesting effekten av slike romanen terapi.

Abstract

Celle- og gene terapi er spennende og lovende strategier for cardiac regenerering i innstillingen av hjertesvikt med redusert utstøting brøkdel (HFrEF). Før de kan bli vurdert for bruk og implementert i mennesker, trengs omfattende prekliniske studier i store dyr modeller for å vurdere sikkerhet, effekt, og skjebnen til injectate (f.eks, stamceller) en gang levert i myokard. Liten gnager modeller har fordeler (f.eks, kostnadseffektivitet, amenability for genetisk manipulasjon); imidlertid oversette gitt iboende begrensninger av disse modellene, funnene i dette sjelden til klinikken. Omvendt, stor dyr modeller som kaniner, har fordeler (f.eks, lignende cardiac elektrofysiologi sammenlignet med mennesker og andre store dyr) samtidig som det beholder en god kostnadseffektivt balanse. Her viser vi hvordan du utfører en PCI kontrast echocardiography-guidede intramyocardial injeksjon (IMI) teknikk, som er minimal invasiv, sikker, godt tolerert og svært effektiv målrettet levering av injectates, inkludert celler, i flere steder i myokard en kanin modell. For gjennomføringen av denne teknikken, har vi også tatt nytte av en utbredt klinisk echocardiography system. Etter å sette i praksis protokollen beskrevet her, en forsker med grunnleggende ultralyd kunnskap vil bli kompetent i utførelsen av denne allsidige og minimal invasiv teknikken for rutinemessig bruk i eksperimenter, rettet mot hypotesetesting av den funksjoner av cardiac regenerativ therapeutics i kanin modellen. Når kompetanse er oppnådd, kan hele prosedyren utføres innen 25 min etter anaesthetizing kaninen.

Introduction

Celle-og genet er spennende og stadig utvikle strategier for å regenerere/reparere skadet myokard i HFrEF. Noen studier har sammenlignet effekten (f.eks, celle oppbevaring rate) av de ulike rutene celle leveringsdatoen, som har konsekvent vist IMI overlegenhet over intracoronary eller intravenøs ruter^{1,2 , 3 , 4 , 5}. dermed, er det ikke overraskende at en stor andel av studier av translasjonsforskning modeller av stilk cellen terapi for skadde myokard, leverer injectate via IMI utført under direkte visning i en åpen kiste prosedyren^6,7 . Denne tilnærmingen har imidlertid flere begrensninger, inkludert invasiv art på prosedyren, som bærer risikoen for peri-prosedyremessige dødelighet (ofte underrapportert)⁸. I tillegg en IMI under direkte utsikt ikke eliminere muligheten for utilsiktet injeksjon i ventrikkel hulrom. I praksis kan en IMI under åpne bryst kirurgi være en hensiktsmessig metode for terapeutisk celle levering, f.eks, under Koronar bypass graft operasjon (CABG); men kanskje denne tilnærmingen ikke passer for cellen levering i globale kardiomyopati ikke-iskemiske opprinnelse (f.eksHFrEF sekundært til anthracycline-indusert kardiomyopati (AICM)).

Det er ingen tvil om at iskemisk hjertesykdom (IHD) er den vanligste årsaken til HFrEF (~ 66%)^9,10; ikke-iskemiske kardiomyopati, inkludert AICM, påvirker imidlertid fortsatt et betydelig antall pasienter med HFrEF (33%)⁹ . Faktisk har nylige fremskritt i clinical oncology resultert i mer enn 10 millioner overlevende av kreft i USA alene¹¹, med anslag over like mange i Europa, samsvar med en generell trend mot bedre overlevelse av pasienter^{12 ,13}. Dermed gitt exploring fordelene av romanen terapi som stilk cellen transplantasjon for ikke-iskemiske kardiomyopati, samt trialing en effektiv og minimal invasiv rute stamcelleforskningen leveringsdatoen er av største betydning, økende antall pasienter påvirket av Kardiotoksisitet sekundær anticancer narkotika.

Av notatet innebærer hypotesetesting studier med stilk cellen terapi å reparer/regenerere skadet myokard ofte bruk av gnagere liten (f.eks, mus og rotter). Disse modellene krever ofte dyre høyfrekvent ultralyd systemer for evaluering av hjerteinfarkt funksjon, som regel utstyrt med lineær array transdusere som har noen iboende tilhørende begrensninger (f.eks, gjenklang)¹⁴. Men har andre modeller som kaniner, som representerer en stor prekliniske modell, noen fordeler for hypotesetesting av stilk cellen terapi i HFrEF. Således, i motsetning til rotter og mus, kanin opprettholde en Ca² transportsystemet og mobilnettet elektrofysiologi som ligner mennesker og andre store dyr (f.eks, hunder og griser)^{15,16,17 ,18,19}. En annen fordel, er deres amenability for cardiac ultralyd imaging bruker relativt billig og tilgjengelig klinisk echocardiography-systemer som er utstyrt med relativt høy frekvens fase matrise transduktorer, f.eks, 12 MHz, som de brukte i neonatal og pediatric kardiologi. Disse systemene tillater utmerket echocardiographic bildebehandling med toppmoderne teknologi, og de tar nytte av overlegenhet harmoniske imaging²⁰. Videre omfattende hypotesetesting av potensialet i cardiac regenerativ Therapy (f.eks, stilk cellen terapi), deres sikkerhet, effekt, cardiomyogenic potensial, samt evaluering av skjebnen til injectate en gang levert til de myokard, er obligatorisk før de kan bli vurdert for menneskelig bruk, og de krever bruk av store prekliniske dyr modeller, for eksempel kanin^17,19. Her beskriver vi en minimal invasiv teknikk for cellen levering via PCI kontrast-echocardiography guidet IMI bruker en klinisk echocardiography system, som er rettet mot stilk cellen transplantasjon-basert terapi for ikke-iskemiske kardiomyopati²⁰ . Vi har også beskriver fordelene med blekk (InI, også kjent som Kina blekk) som en ultralyd kontrast agent og i situ tracer av injectate i kanin hjertet.

Protocol

Eksperimenter beskrevet her ble godkjent av etiske forskning for universitetet i Murcia, Spania, og ble utført i samsvar med direktiv 2010/63/EU til Europakommisjonen. Trinnene beskrevet ble utført under drift standardprotokoller som var en del av planen for arbeid og ikke utført utelukkende for å filme på videoen til dette dokumentet. 1. forberedelse av celler og pattedyr uttrykk vektor Merk: Her, vi kort beskrive en protokoll for utarbeidelse og hva en celle li…

Representative Results

PCI kontrast Echocardiography-guidede IMI med InI: Ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor, og etter optimal plassering av spissen av nålen ble bekreftet av echocardiography og injeksjon startet, transmuralt hyperechogenicity ble observert under levering av InI (10% v/v i PBS) (figur 2E) , så vel som kort tid etter IMI målregion (figur 2F). Når I…

Discussion

Det primære målet var å utvikle en minimal-invasiv metode som kan brukes for levering av stamceller i myokard kanin (en stor størrelse prekliniske dyremodell)^17,18, samtidig utnytter bruk av en relativt rimelig tenkelig system tilgjengelig i mange kliniske og forskning centers. Her viser vi at ved å bruke en klinisk echocardiography, og hjulpet av InI, en utbredt agent, med både i situ sporing evner og echogenic egenskaper, vellykket PCI kontrast e…

Materials

HD11 XE Ultrasound System	Philips	10670267	Echocardiography system.
S12-4	Philips	B01YgG	4-12 MHz phase array transducer
Ultrasound Transmision Gel (Aquasone)	Parket laboratories Inc	N 01-08
Vasovet 24G	Braun	REF 381212	over-the-needle catheter
Omnifix-F 1 ml syringe	Braun	9161406V
Imalgene (Ketamine)	Merial	RN 9767	Veterinary prescription is necessary
Domtor (Medetomidine)	Esteve	CN 570686.3	Veterinary prescription is necessary
Heating Pad
Faber-Castel TG1	Faber-Castel	16 33 99	India (China) Ink
Holter Syneflash	Ela medical	SF0003044S	24 h Holter ECG system.
Electrodes Blue Sensor®	Ambu (NUMED)	VLC-00-S	Holter ECG electrodes.
Microtome	Leica Biosystems	RM2155
Microscope	Olimpus	CO11
ABC Vector Elite	Vector Laboratories	PK-6200	Avidin Biotin Complex Kit.
Chicken anti-GFP antibody	Invitrogen	A10262	Primary antibody.
Biotinylated goat-anti-chicken IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-9010	Secondary Antibody.
3,30-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)	DAKO (Agilent)	S3000
Fluorescence Microscope	Carl Zeiss MicroImaging	Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECG	Elamedical	Syneflash SF0003044S
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Fisher Scientific	11965084
10% fetal calf serum (FCS)	Fisher Scientific	11573397
0.05% Trypsin-Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher Scientific	25300054
Lipofectamine 2000 (Lipid transfection reagent)	Fisher Scientific	11668019
Reduced serum medium (Opti-MEM)	Fisher Scientific	31985070
Hygromycin B	Calbiochem (MERCK)	400051
Xylene (histological)	Fisher Scientific	X3S-4
Hydrogen Peroxide Solution (H2O2)	Sigma	H1009
Pronase	Fisher Scientific	53-702-250KU