DFS70 autoantistoffer efterligne fælles sygdom-associerede antinukleare antistof mønstre gør nøjagtig fortolkning udfordrende, når ved hjælp af konventionelle HEp-2 substrater. Protokollen beskriver fordele af roman manipuleret HEp-2 substrat i forhold til konventionelle HEp-2 i ANA screening og skelne DFS70 mønstre med høj tillid til både monofagligt og blandet ANA positive tilfælde.
Systemisk autoimmun bindevæv er karakteriseret af cirkulerende Antinukleære antistoffer (ANA). Selv om der er flere teknologier til ANA screening, indirekte immunofluorescens (IIF) ved hjælp af menneskelige epitel celler-2 (HEp-2) substrat er fortsat den primære og anbefalede metode på grund af sin overlegne følsomhed. HEp-2 substrater kan registrere et væld af mønstre som følge af autoantistof binding til forskellige protein- og nukleinsyre autoantigens fordelt over hele kernen og cytoplasmaet af celler. Den store mangfoldighed af monofagligt og blandet mønstre som følge af positive reaktioner på HEp-2 substrat også komplicere fortolkningen og nøjagtigheden af rapportering. Et konkret eksempel, som for nylig har modtaget allerstørste opmærksomhed er den tætte fine plettet 70 (DFS70) mønster som følge af autoantistoffer, der specifikt binder til et protein kaldet linse epitel afledt vækstfaktor (LEDGF). Manglen på klare association med en bestemt systemisk autoimmun sygdom og høj prævalens i sunde befolkninger har gjort nøjagtig fortolkning af DFS70 mønster vigtigt. Nøjagtig skelnen mellem DFS70 mønster fra sygdom-associerede mønstre ved hjælp af konventionelle HEp-2 substrat er udfordrende. Endvidere hyppige samtidig forekomst af DFS70 mønster sammen med sygdom-associerede mønstre som homogene, plettet og blandet homogene-plettet mønstre komplicere IIF fortolkning. Målet med dette papir er at påvise nytten af en roman manipuleret HEp-2 IIF substrat, der bevarer alle fordelene ved konventionel HEp-2 substrat samtidig samtidig evnen til at skelne DFS70 mønster med høj tillid i begge monofagligt og blandet ANA positive eksempler. Den nye substrat er yderligere at afsløre sygdomme-associerede ANA mønstre tidligere skjult af DFS70 mønster.
ANAs er kendetegnende for autoimmune medieret systemisk bindevæv sygdomme1. Flere metoder er ansat til screening og bekræftelse af ANAs. IIF teknikken ved hjælp af HEp-2 substrat er stadig den mest udbredte og ofte anbefalet metode til screening af ANAs1,2. Trods fremskridt i faste fase diagnostiske assay metoder, enzym forbundet immunosorbent assay (ELISA), enzym immunoassay (VVM), kemiluminescens-immunassay (CLIA) og perle-baserede multiplex assays er IIF af HEp-2 den mest udbredte screening metoden på grund af dens diagnostiske nytte og omkostninger effektivitet1,2,3. De ovennævnte assay teknologier er afhængige af et begrænset sæt af renset indfødte eller rekombinante autoantigens HEp-2 celle éncellelag præparater på glas dias wells forelaegge en omfattende vifte af autoantigens i deres naturlige form, fordelt på kernen og cytoplasmaet, der reagerer med autoantistoffer fra patient sera eller positive kontroller, hvilket resulterer i et væld af mønstre, der er forbundet med forskellige autoimmune sygdomme. Disse mønstre er klassificeret i nukleare, cytoplasmatisk og mitotiske mønstre baseret på placeringen af antigen i cellerne. Hvert mønster og tilhørende antigen/antigener og sygdom stater er godt præget4. I metoden IIF inkuberes patienten og kontrol sera på glas dias brønde, der præsenterer en éncellelag kultur af HEp-2 celler forsvarligt fastgjort til bevare et væld af autoantigens i deres naturlige konfiguration. Autoantistoffer i patient sera eller positive kontroller er tilladt at binde til autoantigens præsenteret af HEp-2 celler på substrat (glas dias godt) under inkubation. Inkubation, ubundne antistoffer vaskes indlæg af og bundne antistoffer af IgG-klasse er registreret med fluorescein/fluorescein isothiocyanat (FITC) konjugeret-anti-humant IgG reagens. Ubundne rapporterede-konjugat er skyllet væk og glas coverslips er monteret på toppen af dias ved hjælp af en montering medium, der bevarer Reaktionerne og letter observation under et mikroskop for fluorescerende. Reaktioner er observeret under et fluorescens mikroskop udstyret med passende excitation-emission filter kombination, der er konfigureret som reporter bruges (for FITC reporter, en diagnostisk mikroskop typisk bruger filtre med excitation række 467 -498 nm og en emission række 513-556 nm). Tilstedeværelsen af ANA er påvist ved en lyse grønne fluorescens af bestemte strukturer i cellerne. I modsætning til automatiseret assay platforme bygger IIF metode på den besværlige proces med seriel fortynding af sera og visuelle positiv bestemmelse af farvning mønstre som kræver betydelig bruger ekspertise5,6. På trods af disse begrænsninger, IIF af HEp-2 er stadig den mest udbredte og anbefalet metode til screening af ANAs på grund af standardisering indsats mod mønster fortolkning og nomenklatur af den internationale konsensus om ANA mønstre (ICAP) Udvalget, Øget tilgængelighed af automationsløsninger til IIF slide behandling, og resultatet fortolkning3.
Blandt mange mønstre opdaget af HEp-2 IIF metode, autoantistoffer rettet mod psip1 -gen produktet (også benævnt p75-LEDGF-DFS70), har fået betydelig interesse i de seneste år for flere grunde4,5 ,6,7,8,9,10. DFS70 autoantistoffer er til stede i høje titers i raske kontrolpersoner, og undersøgelser har hidtil ikke formået at påvise en særskilt klinisk association for tilstedeværelsen af DFS70 autoantistoffer7,8,9 ,10,11,12,13. Satserne for rapporteret positive resultater for DFS70 autoantistoffer i forskellige sygdomstilstande og sund kohorter varierede meget mellem undersøgelser6,8,9,10,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Monofagligt DFS70 mønster er godt differentieret fra en homogen eller plettet mønster men fortolkning af blandet homogene-plettet mønstre og anti-DFS70 antistoffer Co forekommer med andre ANAs er udfordrende selv til ekspert læsere. Den nuværende generation af IIF screening metoder og DFS70 specifikke faste fase assays er ikke i stand til at skelne en monofagligt DFS70 reaktion fra blandet mønstre (figur 1A, gule skraverede område af algoritme). Fejlfortolkning af DFS70 mønster som homogene, plettet, eller blandet mønster, eller omvendt, kan have alvorlige følger på patientpleje. Den aktuelle anvendte protokol er som følger: de kliniske labs beskæftiger en række faste fase bekræftende prøver for sygdom-associerede ANAs og/eller en immunoadsorption metode til DFS70/LEDGF når tætte fine plettet (AC-2) mønster er mistænkt (figur 1a)4,5.
Målet med denne protokol er at påvise nytten af en roman manipuleret HEp-2 IIF substrat (HEp-2 ELITE/DFS70 knockout (KO), vil blive henvist til som HEp-2 ELITE), bevarer alle fordelene ved konventionel HEp-2 for screening ANAs mens samtidig skelne DFS70 mønster med høj tillid til både monofagligt og blandet ANA positive tilfælde (figur 1B, gule skraverede område af algoritmen)5. HEp-2 ELITE substrat er sammensat af en omtrentlig blanding af umodificerede konventionelle HEp-2 celler og manipulerede celler LEDGF/p75/DFS70 antigen i 1:9 forholdet5. IIF proceduren for HEp-2 ELITE er identisk med metoden konventionelle HEp-2. Den unikke konfiguration af HEp-2 ELITE substrat ikke kun bevarer alle fordelene ved konventionel HEp2 men kan differentiere homogene, plettet og blandet reaktionsmønstre fra DFS70 mønster på den indledende screening eller prøvning af en prøve (figur 1B )5. Patient sera at være reagerede på dias med HEp-2 IIF substrat bør være fortyndet 1:40 med screening fortynding eller som enkelte laboratorium kriterium. En specifik reaktion på 1:40 eller højere titer betragtes som positive.
I denne undersøgelse, positive sera for homogen, plettet, centromer, nucleolar, cytoplasmatisk retikulære/AMA og DFS70 mønstre, der produceres en mellemlang positivt signal (i forhold til den negative kontrol og positiv ANA kontrol af kit) på screening fortynding på 1:40 blev udvalgt til simulering af mono-specifikke og blandet mønstre på substrater til HEp-2 (konventionelle og HEp-2 ELITE). 1:40 fortyndet DFS70 positive sera blev blandet med 1:40 fortyndinger af enkelte sygdom-associerede ANA mønster kontrol (homogen, plettet, centromer, nucleolar, eller cytoplasmatisk retikulære-AMA) i forskellige nøgletal (kontrol: DFS70 i 100:0, 80: 20, 50: 50, 20:80, og 0:100) og vurderet på konventionelle og HEp-2 ELITE substrater efter standard IIF proceduren beskrevet nedenfor.
Autoantistoffer mod nukleare og cytoplasmatisk antigener er meget udbredt i systemiske autoimmune sygdomme. Selv om ingen enkelt analyse giver den bedst mulige følsomhed og specificitet, er IIF af HEp-2 bredt anerkendt som en yderst følsom og omkostningseffektive screeningsmetode for systemiske autoimmune sygdomme2,3,4 . Trods forekomsten af IIF protokol for mere end 50 år er nøjagtigheden af IIF assay stærkt afhængige af dygtighed af tekniker, omhyggelig udførelse af de enkelte trin i protokollen, og præcis fortolkning af resultater ved hjælp af en velholdt Fluorescens mikroskop. Diagnosticering af systemisk autoimmun sygdom bør ikke baseres på resultaterne af en enkelt serologiske test såsom IIF af HEp-2.
Rekonstituering af reagenser ved hjælp af høj kvalitet vand (destilleret/deioniseret), brug af standardiseret kit komponenter (dias med HEp-2 celle encellelag, prøve fortyndingsmiddel, positive og negative kontroller, forud fortyndede optimeret FITC-konjugat og montering medium) have en positiv indvirkning på resultaterne. Springer tilføjelsen af kontroller eller prøver på brønde kan tilskynde falsk negative fortolkninger. Tørring af dias på ethvert tidspunkt efter tilsætning af prøve eller kontrol kan medføre i kunstig falsk positive reaktioner og/eller forkert mønstre. For meget vaskebuffer tilbage på dias eller tørring af dias wells før dispensationen af montering medium kan resultere i artefakter. Tilføje utilstrækkelig mængde af montering medium eller generere bobler på dias overflade før en coverslip kan resultere i reaktioner, som ser slørede eller ud af fokus når observeret under mikroskop. Monterede dias skal opbevares ved 2-8 ° C og analyseres inden for det anbefalede vindue af tid til at minimere falske negative eller kunstig resultater.
Ved hjælp af en velholdt epi-fluorescerende mikroskop, som huser en passende LED/Hg/Xenon lyskilde og ren optiske komponenter herunder excitations- og filtre, der ikke beskadiges er afgørende for at opnå korrekt IIF resultater. Slut bruger træning for kræsne positiv/negativ reaktion Støtteintensiteter og fortolkning af mønstre er kritisk. HEp-2 IIF assays er sårbare over for manglende standardisering i procedurer, mikroskop konfiguration, og undervisning af slutbrugere eller færdighed. Konsensus nomenklatur og repræsentant mønstre og eksempler på billeder anskaffes ved hjælp af forskellige producenter er stillet til rådighed af ICAP () til undervisningsbrug4. En HEp-2 celle mønster klassificeringen træ fra ICAP for forskellige nukleare, cytoplasmatisk og mitotiske mønstre er en værdifuld ressource for at lære de subtile forskelle mellem forskellige mønstre, der kan ligne at utrænede øjne4. En af de primære eksempler på en udfordrende mønster er den DFS70, som også mangler en tydelig tilknytning til en autoimmun tilstand, og som beskrevet i tidligere afsnit dette mønster er meget udbredt i sunde befolkninger5.
Undersøgelsen, forekomsten af anti-DFS70 autoantistoffer variere mellem sund kohorter, ANA screening populationer, og ANA positive personer med ingen tegn på systemisk autoimmun sygdom9,16,20 ,30,31. DFS70 autoantistoffer er blevet rapporteret at forekomme i isolation samt med andre sygdomme-associerede ANA mønstre. Isoleret eller monofagligt DFS70 mønster er rapporteret i 2-22% af raske kontrolpersoner, men i mindre end 1% af tilfældene med autoimmun reumatiske sygdom32. Baseret på disse tendenser, blev DFS70 mono-positive mønster foreslået som kriterium til at udelukke i autoimmun reumatiske sygdomme af ICAP Udvalget3,31,32. ICAP Komité, oprettet for at fremme harmoniseringen af autoantistof test nomenklatur og fortolkning af HEp-2 IIF resultater, anbefaler rapportering DFS70 positivitet mens rapportering ANA screening resultater4.
Før udelukke en systemisk autoimmun sygdom baseret på DFS70 mono-positivitet, er det vigtigt at foretage den nuværende screening og bekræftelse metoder (navnlig specifikt for DFS70). Aftale mellem DFS70 positivitet af HEp-2 IIF og faste fase genfremsatte assays nemlig ELISA, CLIA og line immunassay/dot skamplet metoder) varierede meget mellem forskellige studier13,22,25,33 . IIF fortolkning og bekræftende assay parametre, der bidrager til denne uenighed har været drøftet tidligere5,13,34. En nyligt foreslåede immunoadsorption tilgang til anti-DFS70 antistof bekræftelse omhandler nogle af manglerne i nuværende faste fase assays (for DFS70) men kræver labs til at udføre et ekstra trin i IIF procedure på mistænkte prøver, som øger omkostninger og turnaround tid til rapportering af resultater13. Denne ekstra trin er ikke påkrævet, når HEp-2 ELITE/DFS70 KO celler anvendes til rutine ANA screening. Dette reducerer de samlede omkostninger og desuden er der ingen påvirkning af behandlingstid som DFS70 mønster er skimtes i den indledende screening trin27. En yderligere ulempe ved hjælp af konventionelle HEp-2 IIF metode er, at det er i stand til at skelne DFS70 mønster Co forekommer med andre ANA mønstre på stadiet screening. Denne ulempe er imidlertid overvinde ved hjælp af HEp-2 ELITE/DFS70 KO celler27.
Sammenlignende evaluering af konventionelle HEp-2 og den nye manipuleret HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) ved hjælp af ANA positive kontroller og deres kombinationer med et mono-positive DFS70 kontrol, påvise nytten af den nye substrat evne til samtidigt skærm for ANAs og bekræfte DFS70 mønster (figur 1). IIF-protokollen til de nye substrat er identisk med den konventionelle HEp-2 IIF metode. Fortolkning ordning for alle sygdom-associerede ANA mønstre er identiske med undtagelse af DFS70 mønsteret (tabel 1). Fortolkning af både mono-positive og blandet DFS70 mønstre var relativt lettere ved hjælp af den nye metode og det garanterer ikke yderligere assays (figur 1B). Gennemførelsen af denne nye metode i kliniske lab forenkler udfordringen forbundet med fortolkningen af DFS70 mønster og forbedrer den samlede nøjagtighed af ANA screening af yderligere afslører sygdom-associerede ANA mønstre tidligere skjult af DFS70 (blandet mønstre).
The authors have nothing to disclose.
Vi takke Andrew Zenger udfører IIF eksperimenter og indsamle billeder.
HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
ANA positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
DFS70 antibody positive control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240 | |
Negative control | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstain | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Buffer diluent for serum | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Mounting medium | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
Coverslips | Trinity Biotech | part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240 | |
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouch | Trinity Biotech | part of kit# 1103, 1103-240 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials used in the study but not provided by the kits | |||
Diagnostic fluorescent microscope | Nikon Eclipse 50i | Equipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1 | |
Incubation chamber | Trinity Biotech | provided for customers (no catalog #) | |
Coplin jar | n/a | General labware | |
Paper towels | n/a | General lab supplies | |
distilled/deionized water | n/a | General lab supplies |