Samling och utvinning av yrkesmässig luftprover för analys av svamp DNA
Summary
Bestämma svamp mångfalden inom en miljö är en metod som används i företagshälsovård studier för att identifiera hälsorisker. Det här protokollet beskriver DNA-extraktion från yrkesmässig luftprover för förstärkning och sekvensering av svamp ITS regioner. Denna metod upptäcker många svamp arter som kan förbises av traditionella bedömningsmetoder.
Abstract
Traditionella metoder för att identifiera svamp exponeringar i yrkesmässiga miljöer, såsom kultur och mikroskopi-baserade metoder, har flera begränsningar som har resulterat i uteslutandet av många arter. Framsteg i fältet under de senaste två årtiondena har lett företagshälsovård forskare att vända sig till molekylär-baserade metoder för att identifiera svamp faror. Dessa metoder har resulterat i att upptäcka många arter inom inomhus och yrkesmässiga miljöer som inte har upptäckts med traditionella metoder. Detta protokolldetaljer ett tillvägagångssätt för att bestämma svamp mångfald inom luft prover genom genomisk DNA-extraktion, förstärkning, sekvensering och taxonomisk identifiering av svamp inre transkriberas spacer (ITS) regioner. DESS sekvensering resultat för detektion av många svamp arter som inte är identifierade eller svårt att identifiera till artnivå med kultur eller mikroskopi. Även om dessa metoder inte ger kvantitativa mått svamp börda, de erbjuder en ny strategi för faroidentifiering och kan användas för att fastställa övergripande artrikedom och mångfald inom en arbetsmiljö.
Introduction
Svamp exponeringar i miljöer inomhus och tjänstepensioner kan leda till respiratorisk komorbiditeter, inklusive allergisk sensibilisering och astma1. Identifiering av svamp faror är viktigt för att bedöma risker och förebygga arbetstagarens exponering. Dessa svamp faror kan vara ett resultat av inomhus kontaminering, uteluft intrång eller miljöstörningar som leder till transport av svamp material in i områden där arbetstagare blir närvarande2. Metoder för att bedöma svamp exponering har inkluderat livskraftig kultur provtagning samt mikroskopisk identifiering av svampsporer. Dessa metoder har flera begränsningar och ofta förbiser många svamp arter som kan bidra till den övergripande svamp börda3. Kultur-baserade metoder kan endast skilja dessa livskraftiga svamp organismer som kan odlas på näringssubstrat. Att identifiera svampsporer till artnivå via mikroskopi kan förväxlas av sporer som delar liknande morfologier. Båda metoderna är starkt beroende av mykologer att analysera och identifiera de svamp arterna, med många återstående oidentifierade.
För att förbättra befintliga metoder används i Yrkesrisk identifiering och exponering bedömningar, har många forskare vänt sig till molekylär-baserade tekniker. Sekvensering-baserade metoder för att bedöma mikrobiell mångfald inom miljöer inomhus och tjänstepensioner har avslöjat ett bredare spektrum av svamp arter påträffades jämfört metoder såsom mikroskopi och livskraftig kultur3,4 ,5. Metoden presenteras här beskriver luft provtagning av yrkesmässiga miljöer och utvinning av genomisk DNA för identifiering av potentiella svamp faror. Faroidentifiering åstadkoms genom att sekvensera de nukleära ribosomal inre transkriberas spacer eller ITS, regioner som är mycket varierande bland svampar och har varit vanligt förekommande att skilja svamp arter6,7, 8,9. Många arter Funna i arbetsmiljöer, såsom vissa arter som tillhör fylum basidiesvampar, inte är identifierbara i livskraftig kultur och är svåra att skilja mikroskopiskt. Dessa svampar har observerats i höga relativa överflöd inom inomhus och yrkesmässiga miljöer bedömas av sekvensering svamp ITS regioner3,4,10. DESS sekvensering har gett ökad kunskap i mångfalden av svampar som påträffades inom miljöer inomhus och tjänstepensioner.
Protokollet beskrivs här Detaljer metoderna för att samla, extrahera och förstärka svamp ITS regioner från bioaerosoler för sekvensanalys. Denna strategi använder tredjeparts National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH) två-stegs cyklon aerosol sampler att samla in partiklar i luften. Denna sampler utvecklades för att samla bioaerosoler och separat respirabelt (≤4 µm Aerodynamisk diameter) och icke-respirabla (> 4 µm Aerodynamisk diameter) partiklar, som möjliggör identifiering av svamp organismer inom inomhusmiljöer som är mest sannolikt att inhaleras av en arbetare11. Andra luft samplers, inklusive cyklon samplers, finns tillgängliga på marknaden som har förmågan att samla in partiklar inom intervallet respirabelt (< 4 µm) använder filter12,13. Däremot skiljer NIOSH tvåstegs cyklon aerosol sampler svamp arter utifrån deras aerodynamiska diameter i disponibel, polypropylen rör som kan bearbetas omedelbart nedströms tillämpningar14.
Processerna för utdrager genomiskt DNA och förstärka de svamp ITS regionerna beskrivs i detta protokoll. De utvinning metoder som presenteras har utvecklats speciellt för utvinning av genomisk DNA från svampar och bakterier, som många kommersiella kit rikta däggdjursceller, bakterier eller specifikt jäst15. Primers används i denna studie är utvalda baserat på deras övergripande täckning av både svamp dess 1 och dess 2 regioner4,5. Sekvensering av dessa regioner tillåter jämförelse av många bankas ITS sekvenser, inklusive de som sekvens regionen dess 1, dess 2 region eller både dess 1 och dess 2 regioner. Svamp mångfalden av luftprover insamlade i en inomhus inställningen med hjälp av dessa metoder visas, avslöjar ett betydande antal sekvenser som placeras i phyla Ascomycota och basidiesvampar samt andra sekvenser som tillhör mindre dominerande svamp phyla, såsom Zygomycota. Den breda mångfalden av svamp sekvenserna identifieras med hjälp av denna metod skulle inte fångas med hjälp av traditionella hazard identifiering metoder som odling och mikroskopi. Sekvensering av svamp ITS regioner ger en förbättrad metod för att identifiera svamp faror och möjliggöra en bättre förståelse för inomhus- och tjänstepensionsmyndigheten svamp exponeringar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att bestämma den svamp mångfalden inom en arbetsmiljö med sekvensering-baserade metoder har förbättrat svamp farobedömningen identifiering och exponering. Har tillåtet att använda denna metod för detektion av många ytterligare svamp arter som ofta inte upptäcks med hjälp av kultur eller mikroskopi-baserade metoder för bedömning av. En metod för provtagning bioaerosoler från yrkes- och inomhus miljöer och utvinning av genomisk DNA från luftprover för dess amplifiering och sekvensering presenteras här. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds delvis av en institutionsöverskridande avtal mellan NIOSH och NIEHS (AES12007001-1-0-6).
Materials
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
Riferimenti
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. . Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W., Ruzer, L. S., Harley, N. H. . Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. , (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. . Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
