Electroforesis en Gel bidimensional juntada con métodos de espectrometría de masas para el análisis del proteoma de tejido humano Adenoma pituitario
Summary
Aquí, presentamos una electroforesis en gel bidimensional (2DE) acoplada con espectrometría de masas (MS) para separar e identificar adenoma pituitario humano tejido proteoma, que presenta un patrón de 2DE buena y reproducible. Muchas proteínas se observan en cada punto de 2DE al analizar el proteoma del complejo del cáncer con el uso de MS de alta sensibilidad.
Abstract
Adenoma pituitario humano (PA) es un tumor común que se produce en la glándula pituitaria humana en los sistemas de eje hipotálamo-pituitaria-dirigido del órgano y puede ser clasificado como PA clínica funcional o no funcional (FPA y NFPA). NFPA es difícil para diagnóstico temprano de la etapa y la terapia debido a la elevación apenas de las hormonas en la sangre en comparación con el FPA. Nuestro objetivo a largo plazo es utilizar métodos de proteómica para descubrir biomarcadores fiables para aclaración de los mecanismos moleculares de la PA y el reconocimiento de marcadores eficaces de diagnóstico, pronósticos y dianas terapéuticas. Electroforesis en gel bidimensional efectiva (2DE) junto con métodos de espectrometría de masas (MS) fueron presentados aquí para analizar proteomas humanos de PA, incluyendo la preparación de muestras, electroforesis 2D, visualización de proteínas, análisis de imagen, en gel digestión de la tripsina, péptido masiva de huellas dactilares (PMF) y tándem masa espectrometría (MS/MS). 2-dimensional gel electroforesis láser asistida por matriz desorción/ionización espectrometría de PMF (2DE MALDI MS PMF), 2DE MALDI MS/MS y MS/MS procedimientos de cromatografía de líquidos de 2DE (LC) se han aplicado con éxito en el análisis del proteoma de la NFPA. Con el uso de un espectrómetro de masas de alta sensibilidad, muchas proteínas se identificaron con el método de 2DE-LC-MS/MS en cada gel 2D en un análisis del complejo tejido de PA para maximizar la cobertura de proteoma humano de PA.
Introduction
PA es un tumor común que se produce en la glándula pituitaria humana en los sistemas de eje hipotálamo-pituitaria-dirigido del órgano, que desempeñan un papel importante en el sistema endocrino humano. PA incluye clínicamente funcionales y no funcionales PAs (FPA y NFPA)1,2. NFPA es difícil en terapia y diagnóstico temprano de la etapa debido a niveles de la hormona sólo ligeramente elevada (p. ej., LH y FSH) en sangre en comparación con el FPA, que se ha incrementado significativamente los niveles de hormonas correspondientes en sangre3,4 ,5. La clarificación de los mecanismos moleculares y el descubrimiento de biomarcadores eficaces tienen importante significado clínico en el diagnóstico, tratamiento y pronóstico de la NFPA. Nuestro objetivo a largo plazo es desarrollar y utilizar métodos de proteómica para el estudio de NFPA para el descubrimiento de biomarcadores fiables para aclarar sus mecanismos moleculares y reconocer dianas terapéuticas eficaces así como marcadores diagnósticos y pronósticos. 2-DE junto con métodos de MS se han utilizado en nuestro programa de investigación a largo plazo humano PA proteoma1,2,6,7, incluido el establecimiento de referencia de proteoma los mapas3,8, análisis de proteínas expresadas diferencialmente los perfiles9,10,11,12,13, variantes de hormona14 ,15, modificaciones post-traduccionales como fosforilación14 y tirosina nitración16,17,18, la variación de Proteómica del invasor relativos al no invasiva NFPAs19y la heterogeneidad de Proteómica de NFPA subtipos13, que condujo al descubrimiento de múltiples redes de camino importante (disfunción mitocondrial, disregulación del ciclo celular, estrés oxidativo y señalización MAPK anormalidad del sistema) que se alteran en NFPA13,19,20.
2de separa las proteínas según su punto isoeléctrico (pI) (isoeléctrica, IEF) y peso molecular (a través de sodio dodecil sulfato poliacrilamida gel electroforesis, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. se trata de una técnica de separación común y clásica en el campo de la proteómica, desde la introducción de los conceptos del proteoma y proteómica en 199524. MS es la técnica fundamental para la búsqueda de la identidad de proteínas separadas por 2DE, incluyendo estrategias de PMF y MS/MS. El muy rápido desarrollo de los instrumentos MS, especialmente en los aspectos de la sensibilidad de la detección y resolución en combinación con la mejora del sistema de LC, mejora en gran medida la identidad de las proteínas de baja o muy baja abundancia en un proteoma para maximizar la cobertura de un proteoma. También desafía los conceptos tradicionales que sólo uno o dos proteínas están presentes en un punto en el análisis del proteoma de tejido humano complejo de gel 2D y ofrece una oportunidad para identificar múltiples proteínas en un gel 2D en un análisis de tejido humano complejo proteoma y maximizar la cobertura de proteoma NFPA.
Aquí describimos protocolos detallados de 2DE MALDI MS PMF, 2DE MALDI MS/MS y 2DE-LC-MS/MS que se han utilizado con éxito en el análisis del proteoma humano de NFPA. Los protocolos incluyen la preparación de muestras, la primera dimensión (isoeléctrica, IEF), segunda dimensión (SDS-PAGE), visualización de las proteínas (plata y tinción azul de Coomassie), análisis de gel 2D, digestión de la tripsina en gel, de imagen purificación de péptidos trípticos, PMF, MS/MS y abrasador3,8,25,26la base de datos. Por otra parte, este protocolo se traduce fácilmente para el análisis de otros proteomas de tejidos humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
2de, juntada con MS métodos incluyendo 2DE MS PMF y 2DE-MS/MS, se ha utilizado con éxito en nuestro programa a largo plazo – el uso de la proteómica al estudio humano NFPA proteómicos variaciones y las variaciones de la red molecular para la elucidación de mecanismos moleculares y descubrimiento de biomarcadores eficaces para NFPAs. Proteómica comparativa basada en 2de con buena reproducibilidad desempeña un papel importante en la identificación de NFPA proteómicos variaciones9,</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant no. 81572278 y 81272798 a XZ), las subvenciones del proyecto de Plan “863” de China (Grant No. 2014AA020610-1 a XZ), los fondos del Hospital de Xiangya de talento introducción (XZ) y el Hunan Fundación Provincial de Ciencias naturales de China (Grant No. 14JJ7008 a XZ). Los autores también reconocen la contribución científica de Dr. Dominic M. Desiderio en el Health Science Center de la Universidad de Tennessee. X.Z. continuamente desarrollado utiliza métodos 2DE-MS para analizar el proteoma del adenoma pituitario a partir de 2001, concibió el concepto para el presente manuscrito, escribió y revisó el manuscrito, coordinó el trabajo pertinente y fue responsable de la apoyo financiero y trabajo correspondiente. Y.L. participó en la revisión del manuscrito. Y.H participó en la colección de referencias y la revisión del manuscrito. Todos los autores aprobaron el manuscrito final.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
Riferimenti
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