التصور "تشكيل بيوفيلم" في المبيضات البيض باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي
Summary
ويصف هذا البروتوكول استخدام جهاز موائع جزيئية الآلي للتخصيص لتصور تشكيل بيوفيلم في المبيضات البيض تحت ظروف فسيولوجية المضيف.
Abstract
المبيضات البيض هي الأكثر شيوعاً الممرض الفطرية للبشر، مما تسبب في حوالي 15% حالات الانتان المكتسبة في المستشفى. هو سمة فوعة رئيسية من المبيضة لها القدرة على شكل الأغشية الحيوية، والمجتمعات تنظيماً للخلايا التي تعلق على السطوح الحيوية وغير الحيوية. يمكن أن تشكل الأغشية الحيوية المبيضة على أنسجة المضيف، مثل الطبقات المخاطية، والأجهزة الطبية، مثل القسطرة ومنظم نبضات القلب، وأطقم الأسنان والأطراف الصناعية المشتركة. الأغشية الحيوية تطرح تحديات سريرية هامة لأنها شديدة المقاومة للاضطرابات الفيزيائية والكيميائية، ويمكن أن تعمل كخزانات للبذور نشر العدوى. وقد استخدمت مختلف في المختبر فحوصات لدراسة تكوين بيوفيلم المبيضة ، مثل microtiter لوحة فحوصات وقياسات الوزن الجاف وفحوصات سلامة الخلية ومجهرية ليزر المسح [كنفوكل]. كل من هذه الاختبارات فحوصات نقطة نهاية واحدة، حيث يتم تقييم تشكيل بيوفيلم في نقطة زمنية محددة. وهنا يصف لنا بروتوكولا لدراسة تشكيل بيوفيلم في الوقت الحقيقي باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي تحت ظروف التدفق الصفحي. يسمح هذا الأسلوب للمراقبة لتشكيل بيوفيلم بيوفيلم يتطور مع مرور الوقت، استخدام الشروط القابلة للتخصيص التي تحاكي تلك المضيفة، مثل تلك التي ووجهت في القسطرة والأوعية الدموية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم عيوب بيوفيلم طفرات وراثية وكذلك الآثار المثبطة لمضادات الجراثيم في التنمية بيوفيلم في الوقت الحقيقي.
Introduction
المبيضات البيض عضو commensal الحجمية البشرية، إلا وهو أيضا الممرضات انتهازية، القادرة على التسبب بالأمراض الفطرية السطحية وحادة1،2. سمة فوعة رئيسية من المبيضة هو قدرته على نموذج مرن والأغشية الحيوية مقاومة للعقاقير، مجتمعات خلايا انضمت إلى سطح والمغلقة في مواد1،مصفوفة خارج الخلية3. الأغشية الحيوية المبيضة عالية منظم، الذي يحتوي على عدة طبقات من أنواع متعددة من الخلايا (جولة الناشئين الخميرة على شكل الخلايا والخلايا بسيودوهيفال البيضاوي وخلايا أصله أنبوبي)4. المبيضة بيوفيلم التنمية يبدأ مع التمسك بخلايا الخميرة جولة-نموذج سطح (البذر في بيوفيلم)، تليها انتشار هذه الخلايا على السطح، وثم هيكل نضوج بيوفيلم غير ناضجة في بيوفيلم تشكيل تماما محاط ب المواد المصفوفة خارج الخلية4. بيوفيلم ناضجة الغالب تتألف من خلايا أصله ممدود التي تشكل شبكات كثيفة ومترابطة، وتوفير الاستقرار المعمارية إلى بيوفيلم4. طوال دورة الحياة بيوفيلم، جولة الناشئين الخميرة الخلايا تفريق من بيوفيلم ناضجة، ويجوز السفر إلى مناطق أخرى من الجسم لتسبب التهابات نشرها أو البذور الأغشية الحيوية الجديدة في،من4مواقع أخرى5. يمكن أن تشكل المبيضة الأغشية الحيوية على السطوح الحيوية، مثل الأسطح المخاطية وفي جميع أنحاء أنسجة المضيف، وعلى الأسطح غير الأحيائية، مثل القسطرة ومنظم نبضات القلب، وأطقم الأسنان والمفاصل الاصطناعية. بسبب خصائص المعاندة للأغشية الحيوية، أنها صعبة للغاية للقضاء على، وفي كثير من الحالات أن استراتيجية العلاج الفعال الوحيد إزالة الأجهزة المصابة4. وبالتالي من الأهمية بمكان للتحقيق في تشكيل بيوفيلم تحت ظروف مماثلة لتلك التي لوحظت في إعدادات السريرية.
وهناك عدة حاسمة في فيفو النماذج الحيوانية المستخدمة لدراسة المبيضة بيوفيلم تشكيل6،،من78؛ بيد أن هذه الدراسات يمكن أن تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وتقتصر على عدد من سلالات ومضادات الجراثيم التي يمكن اختبارها في وقت معين. في المختبر بيوفيلم فحوصات، من ناحية أخرى، تسمح للتقييم السريع والفائق للمركبات المضادة للفطور وسلالات متحولة، وهي أكثر فعالية من حيث التكلفة والأخلاقية من فحوصات بيوفيلم التي تقوم بها في الحيوان نماذج9، 10،،من1112،،من1314. هنا يصف لنا في المختبر مقايسة التي وضعت والأمثل لمراقبة تشكيل بيوفيلم وقتيا تحت الاندفاق الصفحي استخدام موائع جزيئية لتخصيص جهاز14،15. يسمح الفحص للتصور من كل مرحلة من مراحل تكوين بيوفيلم، بما في ذلك الخطوة الأولى التقيد وتكاثر الخلايا، ونضوج بيوفيلم، وتشتت الخلية. المقايسة مفيد أيضا لتصور التغييرات مورفولوجيا الخلية في جميع أنحاء تطوير بيوفيلم.
لوحات ميكروتيتير، والتي تستخدم عادة في المختبر فحوصات بيوفيلم، بينما إنتاجية عالية، لا تسمح لظروف التدفق التي تسيطر عليها. تسمح أنظمة الخلية الاندفاق الصفحي التقليدية للتقييم المستمر لتشكيل بيوفيلم في ظروف التدفق التي تسيطر عليها، ولكن هذه غالباً ما تستغرق وقتاً طويلاً لإعداد وتميل إلى التحكم الديناميكي وإنتاجية محدودة. الجهاز موائع جزيئية المستخدمة هنا يتغلب على هذه القيود من خلال الجمع بين لوحات الإنتاجية العالية (التي تحتوي على آبار 48) مع دائرة الاندفاق الصفحي مدمج واستنساخه عاليا وتنوعاً، وقابلة للتخصيص.
وهنا، يمكننا وصف بروتوكول لاستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي المتاحة تجارياً لتقييم تكوين بيوفيلم البرية من نوع المبيضة سلالة، آثار عامل مضاد فطري معروف على تطوير بيوفيلم، وبيوفيلم تشكيل في سلالات متحولة اثنين (bcr1Δ/Δ و efg1 Δ/Δ) التي تم الإبلاغ عنها سابقا أن يكون بيوفيلم العيوب في المختبر و في فيفو16،،من1718. يمكن استخدامها في وصف بروتوكول اختبار فعالية مضادات الجراثيم في تثبيط تكوين بيوفيلم في جميع أنحاء تطوير بيوفيلم، وتحديد الجينات المطلوبة للتنمية بيوفيلم العادي بفحص مكتبات متحولة.
Protocol
Representative Results
Discussion
والرزن بيوفيلم موائع جزيئية للتخصيص الموضحة هنا يسمح لتصور تشكيل بيوفيلم في الوقت الحقيقي على مستوى خلية واحدة عندما تتعرض إلى معدل ثابت الاندفاق الصفحي ودرجة حرارة ثابتة. ويوفر وسيلة قوية لدراسة تطوير الأغشية الحيوية في السلالات البرية من نوع ومتحولة، ولوحظت آثار المعالجات عامل مضادات…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر جميع أعضاء المختبر Nobile لإجراء مناقشات مفيدة في فحوصات بيوفيلم. وأيد هذا الدراسة المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) منحة R21 AI125801 (C.J.N.). وأيد D.L.R. على زمالة دكتوراه من جامعة “معهد كاليفورنيا” للمكسيك والولايات المتحدة (UC-مكسيوس) y Consejo ناسيونال دي العلوم تكنولوجيا (المجلس الوطني).
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
Riferimenti
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
- Fox, E. P., Nobile, C. J., Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. . Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. , 1-24 (2013).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
- Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
- Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
- Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Baker, K. . At the bench: A laboratory navigator. 27, (2005).
