Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Geräts anpassbare automatisierte mikrofluidischen Biofilmbildung in Candida Albicans unter physiologischen Bedingungen Host zu visualisieren.
Abstract
Candida Albicans ist der häufigste pilzliche Erreger des Menschen, was etwa 15 % der Fälle von nosokomialen Sepsis. Eine größere Virulenz-Attribut von C. Albicans ist seine Fähigkeit, Form Biofilme, strukturierten Gemeinschaften von Zellen zu biotischen und abiotischen Oberflächen befestigt. C. Albicans Biofilme bilden können auf Host Gewebe, wie z. B. Schleimhaut Schichten und medizinischen Geräten wie Herzschrittmachern, Katheter, Zahnersatz und Gelenkprothesen. Biofilme stellen signifikante klinische Herausforderungen, weil sie sehr widerstandsfähig gegen physikalische und chemische Störungen sind und können als Stauseen Samen Infektionen verbreitet wirken. Verschiedene in-vitro- Assays wurden genutzt, um C. Albicans Biofilmbildung wie Mikrotiter-Platte-Assays, Trockengewicht Messungen, Zelle Lebensfähigkeit Assays und konfokale Lasermikroskopie Scan zu studieren. Alle diese Tests sind einzelne Endpunkt Assays, wo Biofilmbildung zu einem bestimmten Zeitpunkt bewertet. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Biofilmbildung in Echtzeit mit einem automatisierten mikrofluidischen Gerät unter Laminar-Flow-Bedingungen zu studieren. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der Biofilmbildung wie der Biofilm entwickelt sich im Laufe der Zeit mit anpassbaren Bedingungen, die denen der Host, wie denen in Gefäßkathetern nachahmen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, die Biofilm-Defekte genetische Mutanten und die hemmenden Auswirkungen von antimikrobiellen Wirkstoffen auf Biofilm Entwicklung in Echtzeit einzuschätzen.
Introduction
Candida Albicans gehört Kommensalen der menschlichen Mikrobiota, aber es ist auch eine opportunistische Erreger, verursachen oberflächliche und schweren Pilzinfektionen1,2. Eine größere Virulenz-Eigenschaft von C. Albicans ist seine Fähigkeit, Form elastisch und resistente Biofilme Gemeinschaften von Zellen eine Oberfläche eingehalten und eingeschlossen in eine extrazelluläre Matrix-Werkstoff-1,–3. C. Albicans Biofilme sind hochgradig strukturiert, mit mehreren Schichten von mehreren Zelltypen (angehende Hefe-Form Runde Zellen, ovale pseudohyphal Zellen und röhrenförmigen Bodenaggregaten Zellen)4. C. Albicans Biofilm Entwicklung beginnt mit der Einhaltung runden Hefe-Form Zellen eine Oberfläche (Aussaat des Biofilms), gefolgt von der Verbreitung dieser Zellen an der Oberfläche, und dann die Reifung des unreifen Biofilms Struktur in eine voll ausgebildet Biofilm, die extrazelluläre Matrix Material4umgeben ist. Der Reife Biofilm besteht überwiegend aus länglichen Bodenaggregaten Zellen, die Dichte und miteinander verbundenen Netzwerken, die architektonischen Stabilität, der Biofilm-4bilden. Über den gesamten Lebenszyklus der Biofilm Runde Knospen Hefe Zellen zerstreuen von der Reife Biofilm und können Reisen in andere Regionen des Körpers zu disseminierte Infektionen verursachen oder Samen neue Biofilme an anderen Standorten4,5. C. Albicans können auf biotische Oberflächen, z. B. Schleimhaut-Oberflächen und in der gesamten Wirtsgewebe, und abiotischen Oberflächen, wie z.B. Kathetern, Herzschrittmacher, Zahnersatz und Gelenkprothesen Biofilme bilden. Aufgrund der widerspenstigen Eigenschaften von Biofilmen sie sind extrem schwer zu beseitigen, und in vielen Fällen ist die einzige wirksame Behandlungsstrategie Entfernung des infizierten Gerät4. Es ist so entscheidend für Biofilmbildung unter Bedingungen ähnlich denen beobachtet im klinischen Umfeld zu untersuchen.
Es gibt mehrere kritische in Vivo Tiermodellen zur Untersuchung von C. Albicans Biofilm Bildung6,7,8; aber können diese Studien kostspielig, zeitaufwändig, und sind begrenzt durch die Anzahl der Stämme und antimikrobielle Wirkstoffe, die zu einem bestimmten Zeitpunkt getestet werden können. In-vitro- Biofilm-Assays, auf der anderen Seite ermöglichen die schnelle, Hochdurchsatz-Bewertung von Antimykotika Verbindungen und mutierte Stämme und sind kostengünstiger und ethische als Biofilm Assays durchgeführt Out in Tier9, Modelle 10,11,12,13,14. Hier beschreiben wir eine in-vitro- Tests, die wir entwickelt und optimiert, um die Biofilmbildung zeitlich unter Laminar-Flow mit einem anpassbaren mikrofluidischen Gerät14,15beobachten. Der Test ermöglicht die Visualisierung der einzelnen Phasen der Biofilmbildung, einschließlich der Einhaltung der erste Schritt, Zellproliferation, Biofilm Reifung und Zelle Dispersion. Der Test eignet sich auch Zelle Morphologie Änderungen während der Entwicklung eines Biofilms zu visualisieren.
Mikrotiter-Platten, die in der Regel verwendet werden, für in-vitro- Biofilm-Assays, bei hohem Durchsatz nicht kontrollierten Strömungsverhältnisse zulassen. Traditionelle Laminar-Flow-Zelle-Systeme ermöglichen die kontinuierliche Bewertung der Biofilmbildung in kontrollierten Strömungsverhältnisse, aber diese sind oft zeitaufwändige Einrichten und sind in der Regel nur über begrenzte Dynamikumfang Kontrolle und Durchsatz. Die mikrofluidischen Gerät hier verwendete überwindet diese Einschränkungen durch die Kombination von Hochdurchsatz-Platten (mit 48 Brunnen) mit einer integrierten Laminar-Flow-Kammer und hoch reproduzierbare und vielseitig anpassbar.
Wir beschreiben hier, ein Protokoll für die Verwendung eines handelsüblichen automatisierte mikrofluidischen Geräts Biofilmbildung ein Wildtyp C. Albicans bewerten belasten, die Auswirkungen der bekannten Antimykotikum auf die Entwicklung eines Biofilms und Biofilm Bildung in zwei mutierte Stämme (bcr1Δ/Δ und efg1 Δ/Δ), die zuvor gemeldet wurden, um Biofilm haben Mängel in Vitro und in Vivo16,17,18. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Wirksamkeit antimikrobieller Mittel in der Hemmung der Biofilmbildung während der Entwicklung eines Biofilms zu testen und zu identifizieren, die für normale Biofilm Entwicklung durch screening mutierte Bibliotheken erforderlich.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anpassbare mikrofluidischen Biofilm Assays hier beschriebenen ermöglicht die Visualisierung der Biofilmbildung in Echtzeit auf eine Einzelzelle Niveau, wenn eine Pauschale Laminar-Flow und konstante Temperatur ausgesetzt. Freuen Sie sich auf ein mächtiges Mittel, um die Entwicklung von Biofilmen in Wildtyp und Mutanten Stämme zu studieren, und die Auswirkungen der antimikrobielle Wirkstoff Behandlungen auf Biofilme unter Bedingungen, die physiologische Bedingungen nachahmen im klinischen Umfeld beobachtet. Im Gegensat…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Mitgliedern des Nobile Lab für hilfreiche Diskussionen an Biofilm-Assays. Diese Studie wurde von der National Institutes of Health (NIH) Stipendium R21 AI125801 (C.J.N.) unterstützt. D.L.R. wurde durch ein Promotionsstipendium von der University of California Institute für Mexiko und den Vereinigten Staaten (UC-MEXUS) und Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT) unterstützt.
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
Riferimenti
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