Visualizzazione della formazione di Biofilm in Candida albicans utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzato
Summary
Questo protocollo descrive l’uso di un dispositivo microfluidico automatico personalizzabile per visualizzare la formazione di biofilm in Candida albicans in condizioni fisiologiche host.
Abstract
Candida albicans è il più comune agente patogeno fungoso degli esseri umani, causando circa il 15% dei casi di sepsi nosocomiali. Un attributo di maggiore virulenza dei albicans del c. è la sua capacità di forma biofilm comunità strutturata delle cellule allegate alle superfici biotiche e abiotiche. C. albicans biofilm può formare su tessuti dell’ospite, come ad esempio strati mucosi e sui dispositivi medici, quali cateteri, pacemaker, protesi dentarie e protesi articolari. Biofilm pongono sfide cliniche significative perché sono altamente resistenti alle perturbazioni fisiche e chimiche e può agire come serbatoi per seme diffuse infezioni. Vari saggi in vitro sono state utilizzate per studiare la formazione di biofilm di albicans del c. , come saggi di piastra di microtitolo, misurazioni di peso secco, saggi di vitalità cellulare e confocale microscopia a scansione laser. Tutte queste analisi sono saggi single end-point, dove la formazione di biofilm è valutata a un momento specifico. Qui, descriviamo un protocollo per studiare la formazione di biofilm in tempo reale utilizzando un dispositivo microfluidico automatizzati in condizioni di flusso laminare. Questo metodo permette l’osservazione della formazione di biofilm come biofilm si sviluppa nel tempo, con condizioni personalizzabili che imitano quelli di host, ad esempio quelle incontrate in cateteri vascolari. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare i difetti di biofilm di mutanti genetici nonché gli effetti inibitori degli agenti antimicrobici per lo sviluppo di biofilm in tempo reale.
Introduction
Candida albicans è un commensali membri del microbiota umano, tuttavia è anche un agente patogeno opportunistico, in grado di causare infezioni fungine superficiali e severa1,2. Un tratto di maggiore virulenza dei albicans del c. è la sua capacità di modulo resiliente e biofilm resistente alla droga, comunità di cellule aderito ad una superficie e racchiuso in una matrice extracellulare del materiale1,3. C. albicans biofilm sono altamente strutturato, contenente diversi strati di più tipi di cellule (lievito germogliante-forma tondeggiante cellule, cellule ovali pseudoifale e cellule tubulari ifale)4. Albicans del c. sviluppo di biofilm inizia con l’aderenza delle cellule di lievito-forma rotonda ad una superficie (semina il biofilm), seguita dalla proliferazione di queste cellule sulla superficie, e quindi la maturazione del biofilm acerbo strutturare in un biofilm ben formato che è circondato da matrice extracellulare materiale4. Il biofilm maturo è composto principalmente di cellule hyphal allungate che formano reti dense e comunicanti, fornendo la stabilità architettonica al biofilm4. Tutto il ciclo di vita del biofilm, tondo lievito gemmante cellule disperdono dal biofilm maturo e possono viaggiare ad altre regioni del corpo per causare le infezioni diffuse o seme nuovo biofilm presso altri siti4,5. C. albicans può formare biofilm su superfici biotiche, ad esempio superfici mucose e nel tessuto ospite e su superfici abiotiche, quali cateteri, pacemaker, protesi dentarie e protesi articolari. A causa delle proprietà ricalcitrante del biofilm, sono estremamente difficili da sradicare, e in molti casi la strategia unico trattamento efficace è la rimozione del dispositivo infetto4. È dunque fondamentale per studiare la formazione di biofilm in condizioni simili a quelle osservate nelle regolazioni cliniche.
Ci sono parecchi critici in vivo modelli di animali utilizzati per lo studio di c. albicans biofilm formazione6,7,8; Tuttavia, questi studi possono essere costosa, richiede tempo e sono limitati dal numero di ceppi e agenti antimicrobici che possono essere testati in un dato momento. In vitro biofilm saggi, d’altra parte, consentire la valutazione rapida, ad alta produttività di composti Antifungini e ceppi mutanti e sono molto più redditizi ed etici di biofilm saggi trasportati fuori in animale modelli9, 10,11,12,13,14. Qui descriviamo un test in vitro che abbiamo sviluppato e ottimizzato per osservare la formazione di biofilm temporaneamente sotto flusso laminare usando un personalizzabile microfluidici dispositivo14,15. Il test consente la visualizzazione di ogni fase della formazione del biofilm, compreso il passaggio di adesione iniziale, proliferazione, maturazione del biofilm e dispersione delle cellule. Il dosaggio è anche utile per visualizzare i cambiamenti di morfologia delle cellule durante lo sviluppo di un biofilm.
Piastre di microtitolazione, che vengono in genere utilizzati per in vitro biofilm saggi, mentre a resa elevata, non consentono per condizioni di flusso controllato. Sistemi cellulari tradizionali a flusso laminare consentono la valutazione continua di formazione di biofilm in condizioni di flusso controllato, ma questi sono spesso molto tempo per impostare e tendono ad avere un limitato controllo gamma dinamica e velocità effettiva. Il dispositivo di microfluidica utilizzato qui supera queste limitazioni mediante la combinazione di piastre di throughput elevato (contenente 48 pozzetti) con una camera di flusso laminare incorporato ed è altamente riproducibile, versatile e personalizzabile.
Qui, descriviamo un protocollo per l’uso di un dispositivo microfluidico automatizzati disponibili in commercio per valutare la formazione di biofilm di un selvaggio-tipo albicans del c. ceppo, gli effetti di un noto agente antifungino sullo sviluppo di un biofilm e biofilm formazione in due ceppi mutanti (bcr1Δ/Δ ed efg1 Δ/Δ) che precedentemente sono stati segnalati per avere biofilm difetti in vitro e in vivo16,17,18. Il protocollo descritto può essere utilizzato per testare l’efficacia degli agenti antimicrobici nell’inibire la formazione di biofilm in tutto lo sviluppo di un biofilm e per identificare geni richiesti per la sviluppo di biofilm normale mediante screening di librerie mutante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il dosaggio di biofilm microfluidici personalizzabile descritto qui permette per la visualizzazione della formazione del biofilm in tempo reale a livello di singola cellula quando esposti ad un tasso fisso a flusso laminare e temperatura costante. Fornisce un mezzo potente per studiare lo sviluppo di biofilm in ceppi wild-type e mutanti, e gli effetti dei trattamenti di agente antimicrobico su biofilm in condizioni che mimano condizioni fisiologiche osservate nelle regolazioni cliniche. A differenza della maggior parte <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Nobile per utili discussioni su saggi di biofilm. Questo studio è stato finanziato dal National Institutes of Health (NIH) sovvenzione R21 AI125801 (C.J.N.). DLR è stato sostenuto da una borsa di studio di dottorato presso l’Università di California Institute per il Messico e gli Stati Uniti (UC-MEXUS) e il Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
Riferimenti
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