Visualisering av Biofilm formasjon i Candida albicans bruker en automatisert Microfluidic enhet
Summary
Denne protokollen beskriver bruken av en tilpassbar automatisert microfluidic enhet å visualisere biofilm formasjon i Candida albicans under vert fysiologiske forhold.
Abstract
Candida albicans er den vanligste fungal patogen av mennesker, forårsaker ca 15% av sykehus-ervervet sepsis. En stor virulens attributt for C. albicans er dens evne til å skjemaet biofilm, strukturert samfunn av celler knyttet til biotiske og abiotiske flater. C. albicans biofilm kan danne vert vev, som slimhinnene lag, og medisinske enheter, for eksempel katetre, pacemaker, proteser og felles proteser. Biofilm utgjøre betydelige klinisk utfordringer fordi de er svært motstandsdyktig mot fysiske og kjemiske forstyrrelser, og kan fungere som reservoarer til frø spres infeksjoner. Ulike i vitro analyser har vært benyttet for å studere C. albicans biofilm formasjonen, som være ferdig innen plate analyser, tørr vekt mål, celle levedyktighet analyser og AC confocal skanning laser mikroskopi. Alle disse analyser er enkelt end-point analyser, der biofilm formasjon er vurdert på et bestemt tidspunkt. Her beskriver vi en protokoll for å studere biofilm formasjon i sanntid ved hjelp av en automatisert microfluidic enhet under laminær strømningsforhold. Denne metoden gjør observasjon av biofilm formasjon som biofilm utvikler seg over tid, passelig betingelser som etterligner de av verten, som de i vaskulær katetre. Denne protokollen kan brukes til å vurdere biofilm defekter genetisk mutanter samt hemmende effekten av antimikrobielle midler på biofilm utvikling i sanntid.
Introduction
Candida albicans er commensal med den menneskelige bakterieflora, men det er også en opportunistisk patogen, kan forårsake overfladiske og alvorlig fungal infeksjoner1,2. En stor virulens egenskap av C. albicans er evnen til å danne spenstig og resistente biofilm, samfunn av celler overholdt en overflate og omsluttet av en ekstracellulær matrix materiale1,3. C. albicans biofilm er svært strukturert, som inneholder flere lag flere celletyper (runde spirende gjær-skjemaet celler, ovale pseudohyphal celler og rørformede hyphal celler)4. C. albicans biofilm utvikling begynner med tilslutning celleområde runde gjær-skjemaet til en overflate (såing av biofilm), etterfulgt av spredning av disse cellene på overflaten, og deretter modning av den umodne biofilm strukturen i en fullt dannet biofilm som er omgitt av ekstracellulær matrix materiale4. Den modne biofilm består hovedsakelig av langstrakte hyphal celler som tett og sammenkoblede nettverk, å gi arkitektoniske stabilitet til biofilm4. Gjennom hele livssyklusen biofilm rundt spirende gjær spre fra de eldre biofilm og kan reise til andre deler av kroppen for å føre spres infeksjoner eller frø nye biofilm på andre nettsteder4,5. C. albicans kan danner biofilm biotiske overflater, for eksempel mucosal overflater og hele vert vev, og abiotiske flater, for eksempel katetre, pacemaker, proteser og protese ledd. På grunn av gjenstridige egenskapene til biofilm, de er svært vanskelig å utrydde, og i mange tilfeller det bare effektiv behandling strategien er fjerning av infisert enheten4. Det er derfor avgjørende å undersøke biofilm formasjon under forhold som ligner de i klinisk innstillinger.
Det er flere kritiske i vivo dyr modeller brukes til å studere C. albicans biofilm formasjon6,7,8; men disse studiene kan være kostbart, tidkrevende, og er begrenset av antall stammer og antimikrobielle midler som kan testes på et gitt tidspunkt. In vitro biofilm analyser, derimot, tillater rask, høy gjennomstrømming vurdering av soppdrepende forbindelser og mutant stammer, og er mye mer kostnadseffektiv og etisk enn biofilm analyser båret ut i dyr modeller9, 10,11,12,13,14. Her beskriver vi i vitro analysen som vi utviklet og optimalisert for å observere biofilm formasjon timelig under laminær strømning bruker en passelig microfluidic enheten14,15. Analysen gir effekten av hvert trinn i biofilm formasjon, inkludert overholdelse av første trinn, celle spredning, biofilm modning og celle spredning. Analysen er også nyttig å visualisere cellen morfologi endringer i utviklingen av en biofilm.
Være ferdig innen platene som benyttes vanligvis for i vitro biofilm analyser, mens høy gjennomstrømning, tillater ikke for kontrollert strømningsforhold. Tradisjonelle laminær strømning celle systemer tillater kontinuerlig vurdering av biofilm formasjon i kontrollerte strømningsforhold, men disse er ofte tidkrevende å definere og pleier å ha begrenset dynamisk rekkevidde-kontroll og gjennomstrømning. Microfluidic enheten brukes her overvinner disse begrensningene ved å kombinere høy gjennomstrømning plater (inneholder 48 brønner) med en innebygd laminær strømning kammer og er svært reproduserbare, allsidig og kan tilpasses.
Her beskriver vi en protokoll for bruk av en kommersielt tilgjengelig automatiserte microfluidic enhet å vurdere biofilm dannelsen av en vill-type C. albicans belastning, effekten av en kjent soppdrepende middel på utviklingen av biofilm og biofilm formasjon i to mutant stammer (bcr1Δ/Δ og efg1 Δ/Δ) som tidligere ble rapportert å ha biofilm defekter i vitro og vivo16,17,18. Beskrevet protokollen kan brukes til å teste effekten av antimikrobielle midler i hemme biofilm formasjon hele utviklingen av en biofilm, og identifisere tilblivelse kreves for vanlig biofilm utvikling av screening mutant biblioteker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passelig microfluidic biofilm analysen beskrevet her gir visualisering av biofilm formasjon i sanntid på en enkelt cellenivå når de utsettes for en fast rente laminær strømning og konstant temperatur. Det gir en kraftig måte å studere utviklingen av biofilm i vill-type og mutant stammer, og effekten av antimikrobiell agent behandlinger biofilm under forhold som etterligner fysiologiske forhold observert i klinisk innstillinger. I motsetning til de fleste i vitro biofilm analyser, gir denne metoden unders?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle medlemmer av Nobile laboratoriet nyttig diskusjoner på biofilm analyser. Denne studien ble støttet av National Institutes of Health (NIH) grant R21 AI125801 (til C.J.N.). D.L.R. ble støttet av et universitet fellesskap fra University of California Institute for Mexico og USA (UC-MEXUS) og Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
Riferimenti
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
- Fox, E. P., Nobile, C. J., Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. . Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. , 1-24 (2013).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
- Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
- Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
- Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Baker, K. . At the bench: A laboratory navigator. 27, (2005).
