Det här protokollet beskriver en ny metod som möjliggör kvantitativa visualisering av komplexa bildandet av SNARE proteiner, baserat på Förster resonans energiöverföring och fluorescens livstid imaging mikroskopi.
Lösliga N– ethylmaleimide känslig fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARA) proteiner är nyckel för membran människohandel, som de katalyserar membran fusion inom eukaryota celler. Familjen SNARA protein består av cirka 36 olika medlemmar. Specifika intracellulära transportvägar är katalyseras av specifika uppsättningar av 3 eller 4 SNARE proteiner som därmed bidrar till specificitet och trohet för membran människohandel. Dock studera funktionen exakt SNARE proteiner tekniskt utmanande, eftersom snaror är mycket rikligt och funktionellt överflödig, med de flesta snaror att ha flera och överlappande funktioner. I detta protokoll beskrivs en ny metod för visualisering av SNARA komplexa bildande i levande celler. Denna metod är baserad på uttrycka SNARE proteiner C-obotligt smält till fluorescerande proteiner och mäta deras interaktion av Förster resonans energi överföring (bandet) anställa fluorescens livstid imaging mikroskopi (FLIM). Genom att montera fluorescens livstid histogram med en flerkomponents decay modell, tillåter bandet-FLIM (semi-) kvantitativ uppskattning av andelen SNARA komplexa bildandet på olika blåsor. Detta protokoll har tillämpats framgångsrikt för att visualisera SNARA komplexa bildande vid plasmamembranet och endosomal fack i däggdjursceller linjer och primära immunceller, och lätt kan förlängas för att studera SNARA funktioner på andra organeller i djur, växt och svampceller.
Membranet människohandel är en central del av eukaryota celler, där membranet blåsor knoppas av från en donator organell och sedan flytta till och säkring med en target organell1,2. Förutom mitokondrierna, är alla dessa membran fusion steg katalyseras av medlemmar av SNARA protein familj1,2. Familjen SNARA protein består av cirka 36 medlemmar i däggdjursceller och ca 20 medlemmar i jäst2. SNARE proteiner innehåller en eller två ~ 52 rester-lång, inbyggt ostrukturerade regioner, kallade SNARA-motiv. SNARE proteiner är ofta bundna till membran med en C-terminal transmembrana helix1,2. Snaror kan kategoriseras utifrån de centrala restsubstanser som de bidrar till den komplexa SNARAN till arginin (R) och glutamin (Q) snaror1,2. Membranet fusion drivs av samspelet mellan 3 eller 4 cognate snaror som tillsammans bidrar 4 SNARA-motiv och är fördelade över både givare och acceptor membran1,2. En SNARE-komplexet består av en R-SNARA motiv och tre Q-SNARA motiv (kallas Qa, Qb och Qc). Komplexa bildande startar på N-termini av SNARA-motiven, bildar en så kallad trans-SNARA-komplex, och fortsätter mot C-termini, bildar en tät α-spiralformade dubbeltvinnade bunt kallas en cis-SNARA-komplex. Komplexa bildandet av ens en enda SNARA komplexa drar givare och acceptor membran tillsammans och övervinner energibarriären för membran fusion3.
Tilldela särskilda transportvägar inom celler distinkta SNARA komplex ofta tekniskt utmanande. Även om snaror bidrar klart till specificiteten av membran som människohandel, de är promiskuösa, funktionellt överflödig, och deras funktioner överlappar1,2. På grund av detta leder störning experiment inriktning snaror, som av genen knockout, RNA-interferens, införandet av blockering antikroppar eller med lösliga SNARA fragment egenskap av dominerande negativ, ofta inte till tydliga fenotyper som andra Snaror kompensera2,4. Dessutom är det svårt att skilja specifika membran fusion steg från uppströms människohandel händelser, eftersom snaror kan vara inblandade i flera transport rutter2. Lokaliseringsutredningar av snaror av mikroskopi metoder, använda immunolabeling eller genetisk fusion fluorescerande reporter proteiner, lida av problem som: (i) snaror hitta till flera organeller som de förmedlar ofta flera människohandel steg, och (ii) deras lokaliseringar menar inte automatiskt de funktionellt bedriver SNARA komplexa bildande. Slutligen, SNARA komplex kan identifieras med hjälp av immunoprecipitation experiment med en av snaror som bete och andra snaror som mål, men detta tillåter inte överlåtelse av dessa komplex till särskilda organeller eller handelsvägar. Således, för närvarande finns det inga alternativ teknik för att visualisera SNARA komplex med organellar upplösning. Immunofluorescens är inte kunna bevisa SNARA interaktioner men kan visa endast av närvaro eller frånvaro av samtidig lokalisering, medan immunoprecipitation endast kan visa SNARA interaktioner i hela cellen befolkningen men inte tilldela organeller där dessa interaktioner förekomma.
För att övervinna dessa begränsningar, har en ny metod som möjliggör kvantitativa visualisering av SNARA komplex inom levande celler med organellar upplösning nyligen utvecklats av Verboogen et al. 5 denna metod är baserad på uttrycket av par snaror med spektralt skiftade fluorescerande proteiner smält C-obotligt till sin transmembrana spiraler. Efter slutförandet av membran fusion och bildandet av en cis-SNÄRJA komplexa, dessa fluorophores på C-termini av de transmembrana spiraler är omedelbart kontrasteras till varandra. Fluorophores är då väl inom Förster avståndet (vanligtvis < 5 nm), vilket resulterar i bandet från grön-skiftat givare fluorophore till röd-skiftat acceptor fluorophore5,6. FRET resultat i snabbkylning av givare fluorophore och ökade utsläpp av acceptor fluorophore som kan mätas från nyckeltalen av givare och acceptor utsläpp (proportionerlig bandet). Dock proportionerlig bandet mellan två olika molekyler är utmanande, på grund av fluorescens överhörning och olika nivåer av givare och acceptor snaror på olika organeller och bland celler7,8. BANDET kan också mätas från fluorescens livstid, vilket är tiden mellan excitation och utsläpp av en foton. Om givaren fluorophore kan släppa sin energi av bandet, denna konkurrerande processen resultatet i en skenbar förkortning av fluorescens livstid. Detta kan mätas genom FLIM7,8. Livstid bandet är mycket mer robust än proportionerlig bandet för att mäta interaktionen mellan två olika molekyler, som fluorescens livstid är en inneboende egenskap hos en fluorophore och är okänslig för dess koncentration. Dessutom är bandet tillnärmning kvantitativa, eftersom effektiviteten i bandet är omvänt proportionell mot avståndet mellan den givaren och acceptor fluorophores (i huvudsak en step-funktionen) sjätte makt. Därför, genom att montera fluorescens livstid histogrammen inspelad av FLIM med en dubbel-komponent decay modell, bandet-FLIM möjliggör (semi-) kvantitativ uppskattning av andelen SNARA molekyler bedriver SNARA komplexa bildande5.
Nyligen användes denna bandet-FLIM metod av Verboogen et al. att visualisera SNARA komplexa bildande i primära dendritiska celler i immunsystemet5. Det visades att dendritiska celler vid möter en patogena stimulans, omdirigera sina membran handel åtföljs av en ökad komplexbildande av de R-SNARA vesikler-associerade membranprotein (VAMP) 3 med den Qa-SNARA syntaxin 4 specifikt på den plasmamembranet. Detta ökade SNARA komplexa bildande krävs sannolikt att möta den ökade sekretoriska kapaciteten för utsöndringen av inflammatoriska cytokiner såsom interleukin-65. Det här protokollet beskriver de experimentella steg som behövs för förvärvet av bandet-FLIM data för visualisering och (semi-) kvantitativ mätning av SNARA komplex.Det förklaras hur passar hela-cell fluorescens livstid histogram med mono – och bi-decay exponentialfunktioner, vilket resulterar i skenbara fluorescens livstid som en kvantitativ uppskattning att SNARA interaktioner. I detta protokoll, den utbredda HeLa cellinje används som ett exempel, men metoden kan lätt utvidgas studera SNARA komplex i andra eukaryota celler.
Detta protokoll visar användningen av bandet-FLIM för visualisering av SNARA interaktioner mellan syntaxin 4 och VAMP3 i live HeLa cells. Syntaxin 4 är en Qa-SNARA protein huvudsakligen att lokalisera på plasmamembranet där det förmedlar exocytos1,2,20,21. VAMP3 är en R-SNARA som huvudsakligen beskrivs för att leta reda på återvinning endosomal fack och medlar människohandel till andra endosomes samt att plasmamembranet1,2,20. Men kan bandet-FLIM analysen lätt anpassas för att studera andra SNARE proteiner. Det enda villkoret är att dessa snaror innehåller en C-terminal transmembrana helix, vilket är fallet för de flesta SNARE proteiner av långt1,2. Protokollet beskrivs här kan dessutom anpassas för visualisering av SNARA komplex i någon eukaryot celltyp, inklusive växter och jäst. I detta protokoll använde vi förkortningen av givare fluorophore fluorescens livstid som ett mått på bandet. Som en kompletterande strategi, livstid acceptor fluorophore kunde undersökas, eftersom sensibiliserade utsläpp orsakar en distinkt upphov fas som ger otvetydiga bevis att resonans energiöverföring sker.
För närvarande kanske bandet-FLIM tekniken inte att visualisera SNARA komplex i lysosomala facken. För den syntaxin 3-mCitrine-mCherry tandem bygga, kan mCherry fluorescensen ofta hittas mer ackumulerade i ett juxtanuclear område, som sannolikt motsvarar lysosomala fack, medan mCitrine signalen är rikligare i cellulära periferin5. En liknande juxtanuclear ansamling av mCherry jämfört med mCitrine observerades, när samma SNARE proteiner smält till dessa fluorescerande proteiner var samtidig uttryckt5. Lysosomer kännetecknas av en extremt lågt pH (< 4) och en hög aktivitet av proteolytiska enzymer. Juxtanuclear ansamling av mCherry orsakas sannolikt av ett högre motstånd av mCherry fluorophore till lysosomal degradering jämfört med mCitrine fluorophore. Det är inte på grund av pH-kylning av mCitrine, som juxtanuclear ansamling av mCherry uppstår även vid fixering av celler5. Således, bandet-FLIM tekniken underskattar mängden bandet i juxtanuclear (lysosomala) regioner och detta skulle kräva andra fluorescerande reporter proteiner som överlever hårda villkoren inom Lumina i lysosomer.
BANDET-FLIM i princip tillåter för att få en (semi-) kvantitativ uppskattning av andelen av snaror i komplexa5. Som vi förklarat i detta protokoll, kräver detta montering av fluorescens livstid histogram med dubbel-exponentiell förruttnelse funktioner (ekvation 2), där amplituden av snabb komponenten är proportionell mot andelen av snaror i komplexa ( Ekvation 3). Sådan koppling med en två-komponent modell är dock tekniskt utmanande. Montering med flera gratis fit parametrar (två fluorescens livstider och två amplituder) kräver ett mycket stort antal fotoner, särskilt eftersom parametrarna påverkar varandra och små fel i livstid kommer att påverka amplituder och vice versa. För att övervinna dessa montering problem, fluorescens livstidar av komponenten långsam kan fastställas att livslängden på det enda villkoret för givare (dvs, inte FRET, endast mCitrine närvarande) och som av snabb komponenten att tandem livstid konstruera) maximal expectable bandet). Detta bör dock också tolkas med försiktighet, eftersom fluorescens livstider kanske inte samma som dessa kontroll stater, och skulle kunna avvika på grund av flera skäl (själv släcka, dipol orientering, variationer i närmiljön). Flera SNARA komplex i närheten (< 10 nm) kan resultera i distansera-anhörig bandet, samma princip som gör att bandet ska användas som en ”molekylär härskare”, men i det här fallet döljer kvantifiering av SNARA komplex. Dessutom är en kvantitativ uppskattning inte alltid meningsfullt, eftersom märkta snaror konkurrera med endogena (omärkt) snaror. Som en följd är uttryck mCherry-märkt SNARA en viktigaste faktor för bandet5i procent. På grund av alla dessa varningar rekommenderas det att passa fluorescerande livstid histogram med mono-exponentiell förruttnelse funktion (ekvation 1). Detta har fördelen att det inte kräver någon förhand kunskap om livstiderna och den resulterande uppenbara fluorescerande medellivslängd ger ett fast mått för SNARA komplexbildande5.
Det förväntas dock att kvantitativa bandet-FLIM imaging av tvåkomponents passande modeller kommer att ha potent framtida tillämpningar. SNARA-encoding gener inom kromosomen kan vara smält med fluorescerande reporter proteiner, till exempel av CRISPR/CAS9. Detta resulterar i den fluorescerande märkning av endogena SNARE proteiner, med endogen proteinnivåer och ingen bakgrund av omärkta snaror, och möjliggör därmed en meningsfull kvantitativ uppskattning av andelen av SNARA komplex av bandet-FLIM. Medan uttrycksnivåerna av endogena snaror kan vara ganska låg och ger låga relativt fluorescerande signaler, det förväntas att ett tillräckligt antal fotoner kan erhållas, särskilt för hela cellen FLIM (som kräver endast några 1,000s av fotoner). Dessutom kan dessa bandet-FLIM mätningar utföras med känsligare lavin fotodiod vilket också resulterar i högre fluorescens signaler och bättre photon statistik.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av en Hypatia stipendium från Radboud University Medical Center, en karriär Development Award från Human Frontier Science Program, den Gravitation programmet 2013 från den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO; ICI-024.002.009), en VIDI bevilja från NWO (ALW VIDI 864.14.001) och en Starting Grant från det Europeiska forskningsrådet (ERC) under EU: s sjunde ramprogram (Grant avtal nummer 336479).
Plasmid DNA 'syntaxin 4-mCitrine' | Addgene | ID 92422 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'VAMP3-mCherry' | Addgene | ID 92423 | Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP). |
Plasmid DNA 'syntaxin 3-mCitrine-mCherry' | Addgene | ID 92426 | Positive control for maximum achievable FRET. |
Hela cells | |||
35 mm glass bottom dishes | Willco Wells | HBST-3522 | Other live cell imaging chambers will work as a substitute |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco, Life Technologies | 31966-021 | |
Fetal calf serum | Greiner Bio-one | 758093 | |
Antibiotic-antimycotic solution | Gibco, Life Technologies | 15240-062 | Pen/Strep will work as a substitute |
Live cell imaging medium | Thermo Fisher Scientific | A14291DJ | Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented |
Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective | Leica | SP8 | Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used |
Pulsed white light laser | Leica | SP8 | Other pulsed laser sources can also be used |
Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system | PicoQuant | PicoHarp 300 | |
PT32ICS conversion software | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | ||
data analysis software programme capable of deconvolution | Originlabs | OriginPro 2016 | |
Fiji ImageJ | |||
Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity | Fiji ImageJ | Available at the 'Software'-section of www.membranetrafficking.com | |
Bürker Haemocytometer | VWR | 630-1541 | |
HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
PBS | B Braun Melsungen AG | 362 3140 | |
EDTA 2 mM | Merck | 108417 | CAS: 60-00-4 |
15 mL tubes | Greiner Bio-one | 188271 | |
Trypan blue | Sigma Aldrich | 93595 | CAS: 72-57-1 |
NEON cell electroporation device | Thermo Fisher Scientific | MPK5000S |