Topo adulto DRG Explant e dissociato modelli cellulari per studiare neuroplasticità e risposte agli insulti ambientali, compreso l'infezione virale
Summary
In questo rapporto, vengono evidenziati i vantaggi delle colture organotipiche e colture primarie dissociate di gangli spinali del mouse-derivati per studiare una vasta gamma di meccanismi connessi con interazione neurone-glial, neuroplasticità, neuroinflammation e risposta all’infezione virale.
Abstract
Questo protocollo descrive un modello ex vivo di derivato del mouse radice dorsale gangli (DRG) espianto e in vitro DRG-derivati co-cultura di neuroni sensoriali dissociati e cellule gliali satellitare. Questi sono modelli utili e versatili per indagare su una serie di risposte biologiche associate condizioni fisiologiche e patologiche del sistema nervoso periferico (PNS) che vanno dall’interazione neurone-glial, neuroplasticità, neuroinflammation e infezione virale. L’utilizzo di espianto DRG è scientificamente vantaggiosa rispetto ai modelli semplicistici unicellulari per molteplici ragioni. Per esempio, come una coltura organotypic, explant DRG consente il trasferimento di ex vivo di un’intera rete neuronale, tra cui il microambiente extracellulare che giocano un ruolo significativo in tutte le funzioni neuronali e gliali. Ulteriormente, i DRG espianti possono essere mantenuti anche ex vivo per diversi giorni e le condizioni della coltura possono essere perturbate come desiderato. Inoltre, il DRG raccolte possono essere dissociate ulteriormente nella co-cultura in vitro di neuroni sensoriali primari e cellule gliali satellite per studiare l’interazione di un neurone-glial, neuritogenesis, cono axonal interazione con extracellulare microambiente e più generale, qualsiasi aspetto connesso con il metabolismo di un neurone. Pertanto, il sistema di DRG-espianto offre una notevole flessibilità per studiare una vasta gamma di eventi legati alle condizioni biologiche, fisiologiche e patologiche in un modo economicamente vantaggioso.
Introduction
In questo manoscritto, segnaliamo un metodo per ottenere un modello ex vivo organotipiche di un sistema di modello DRG mouse derivato come un microambiente simil-tessuto conservato per studiare una vasta gamma di risposte biologiche agli insulti PNS che vanno dal neurone-glial interazione, neuroplasticità, indicatori infiammatori, all’infezione virale. Inoltre, abbiamo ulteriormente sviluppato un protocollo per creare una co-cultura primaria di DRG-derivato singoli neuroni sensoriali e cellule satelliti.
Il DRG sono grigio-materia-unità satellite situato di fuori del sistema nervoso centrale (SNC) lungo le radici spinali dorsali dei nervi spinali. DRG, situato in prossimità dei forami intervertebrali, casa pseudounipolar sensoriale neuroni e cellule gliali satellitare. I neuroni pseudounipolar dispongono di un singolo del neurite che si divide in un processo periferico che trasportano ingressi somatici e viscerali da bersagli periferici al corpo cellulare e un processo centrale che invia informazioni sensoriali dal corpo cellulare nel sistema nervoso centrale. Una capsula connettiva definisce e consente di isolare questo cluster periferico dei neuroni e cellule gliali dallo SNC. Nessuna migrazione cellulare postnatale a o dal DRG è mai stato descritto ed una nicchia delle cellule staminali locali è responsabile neurogeni eventi che si verificano nel corso della vita1. Pertanto, questo modello è particolarmente adatto a studiare nella neurogenesi adulta, assonogenesi, risposta alla lesione traumatica e cellule morte2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
Nel campo della neurorigenerazione, DRG raccolte da in vivo ed espiantati in vitro riproduce axonotmesis, una condizione di pregiudizio in cui assoni sono completamente reciso e il corpo cellulare neuronale viene disconnesso dalla destinazione innervata10 ,11. È noto che ferita periferica del nervo può causare l’espressione genica in diminuzione e aumento in DRG e molti di questi cambiamenti sono il risultato dei processi rigenerativi ma molti possono anche essere il risultato della risposta immunitaria o un’altra risposta da cellule non neuronali. Utilizzando un ex vivo sistema di DRG isolato, alcuni di questa complessità è rimosso e meccanicistiche vie è possibile analizzare più facilmente.
Oltre il suo ruolo centrale nel trasmettere input sensoriali al sistema nervoso centrale, l’abbondanza di recettori per molti neurotrasmettitori quali GABA12,13,14,15 a livello del soma neuronale nonché prove di interneuronale Croce-eccitazione possono suggerire che DRG sono sofisticati integratori preliminari di input sensoriali16,17. Queste nuove scoperte conferiscono al explant DRG le caratteristiche di un sistema di rete mini-neuronale simile ad altri modelli di “mini-cervello”, che sono nervoso-tessuto-specifica organoids utilizzato per più ampi campi sperimentali di indagine e terapeutico approccio a malattie neurologiche18,19. Queste evidenze insieme al fatto che il DRG è un cluster discreto e ben definito del tessuto neuronale, circondato da una capsula connettiva, lo rendono un organo adatto per il trapianto di ex vivo .
Coltura mouse DRG presenta un’interessante opzione pluricellulare per modellare pathophysiologies umano dovuto le somiglianze strutturali e genetiche tra le specie. Inoltre, un grande repository di ceppi di topi transgenici è altamente favorevole per futuri studi meccanicistici. Estensione del neurite sia durante lo sviluppo che dopo la ferita richiede interazioni meccaniche tra crescita cono e substrato20,21. Nano – e micro-fantasia substrati sono stati utilizzati come strumenti per diretta conseguenza del neurite e dimostrare la loro capacità di rispondere alle caratteristiche topografiche in loro microambienti. I neuroni sono stati indicati per sopravvivere, aderire, migrare e orientare i loro assoni per navigare caratteristiche superficiali come scanalature in substrati22,23. Tuttavia, questi studi sono in genere utilizzate linee cellulari coltivate ed è difficile prevedere come primario un neurone cellule volontà rispondere agli spunti ben definite e fisico in vivo o ex vivo.
Il modello ex vivo espianto del mouse DRG utilizzati per questa proposta imita l’interazione cellula-cellula reale e segnali biochimici che circonda gli assoni crescenti. Tra i tanti diversi paradigmi sperimentali che vanno dalla rigenerazione assonale, produzione neurosphere, a neuroinfiammazione, DRG explant modello continua a servire come un valido strumento per indagare l’aspetto virale infezione e latenza all’interno sensoriale gangli24,25,26,27.
Il sistema nervoso (SN) in generale è la destinazione per le infezioni virali28,29,30. Maggior parte dei virus infettano superfici delle cellule epiteliali ed endoteliali e si dirigono dal tessuto superficiale al NS via nervo periferico fibre sensoriali e motorie. In particolare, il virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) dopo un’infezione iniziale in cellule epiteliali stabilisce una latenza tutta la vita nei gangli sensoriali preferibilmente, il DRG del PNS31,32. HSV-1 neuroptropic capacità di infettare il PNS infine conduce a malattie neurologiche33.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello DRG ex vivo è estremamente utile per studiare una vasta gamma di eventi quali interazione neurone-glia così come l’effetto del microambiente su entrambi del metabolismo di un neurone e glial37. Ulteriormente, il DRG-modello potrebbe essere utilizzato come uno strumento conveniente per affrontare questioni rilevanti riguardanti il meccanismo patogeno e associati marcatori sviluppando ex vivo sistemi per fase acuta cronica e latente dell’infezione o in una determinata …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo sinceramente l’Imaging core-impianto a Midwestern University (MWU) e il gruppo di studenti [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo e Casey Sigerson] per i loro contributi nella coltura delle cellule e il funzionamento di imaging. Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla MWU intramurale concedere finanziamenti ai fondi di Start-up M.F. e ricerca per V.T.
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
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