Retrograde neuroanatomische tracering van Phrenic motorische neuronen in muizen
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor het identificeren van phrenic motorische neuronen in muizen nadat pleurale levering van fluorophore geconjugeerd cholera-toxine subeenheid bèta. Twee technieken worden vergeleken om te injecteren de pleurale Holte: transdiaphragmatic versus transthoracic benaderingen.
Abstract
Phrenic motorische neuronen zijn cervicale motorische neuronen die afkomstig zijn van C3 tot C6 niveaus in meest zoogdiersoorten. Axonale projecties convergeren in phrenic zenuwen innervating het respiratoire middenrif. In ruggenmerg plakjes, worden niet phrenic motorische neuronen van andere motorische neuronen van morfologische of biochemische criteria geïdentificeerd. Wij bieden de beschrijving van de procedures voor het visualiseren van phrenic motor neuron cel organen in muizen, volgende pleurale injecties voor cholera-toxine subeenheid beta (CTB) geconjugeerd met een fluorophore. Deze fluorescerende neuroanatomische tracer heeft de mogelijkheid om te worden ingehaald op de middenrif motorische eindplaat, retrogradely langs de phrenic axonen worden uitgevoerd en de phrenic cel organen bereiken. Twee methodische opbouw mbt de pleurale CTB levering worden vergeleken: transdiaphragmatic versus transthoracic injecties. Beide benaderingen zijn succesvol en leiden tot soortgelijke aantal CTB-label phrenic motorische neuronen. Kortom, kunnen deze technieken worden toegepast om te visualiseren of te kwantificeren van de phrenic motorische neuronen in verschillende experimentele studies zoals die gericht is op de membraan-phrenic circuits.
Introduction
Het doel van de studie is om een betrouwbare methode om te identificeren phrenic motorische neuronen (filem) op muis ruggenmerg secties. Injectie van een fluorescerende neuroanatomische tracer in de spouw van Pleurale werd gekozen als de leveringsmethode te bereiken de phrenic neuromusculaire projecties op het middenrif en retrograde vervoer langs de phrenic axonen gebruiken om label phrenic cel organen. Twee technieken van Pleurale levering worden beschreven: transdiaphragmatic versus transthoracic.
Phrenic motorische neuronen zijn spinale relay cellen waarvan axonen convergeren in phrenic zenuwen, die uiteindelijk het middenrif innervate. Dit zijn de lagere motorische neuronen het inspiratory station ontvangen de bulbaire respiratoire centra en het doorgeven aan de neuro-musculaire kruispunten van membraan (NMJ). Filem zijn gestructureerd in twee motor kolommen, een voor elke hemicord, loopt langs de medio-cervicale wervelkolom. In de meeste soorten zoogdieren, inclusief de mens, verspreiden de phrenic motor kolommen van niveaus C3 naar C61,2,3. Wij en anderen hebben bevestigd dat filem geconcentreerd in C3-C5-concentraties in de rat en muis ruggenmerg4,5,6,7,8. De topografische verdeling van phrenic cellen is niet willekeurig; motorische neuronen innervating de sternale deel van het middenrif bevinden zich dichter in de craniale deel van het phrenic zwembad van de motor (C3), overwegende dat motorische neuronen innervating de musculus deel meer caudal (C5)9. Bovendien zijn de filem afwisselend geclusterd in het ventrale hoorn grijze stof. Niveau van de C3, de clusters van phrenic cellen liggen lateraal, dan ze verschuiven in de richting van een ventrolateral en ventromedially zijn te vinden op de meest caudal niveaus10,11.
Gezien hun vitale rol tijdens inspiratie, is het van het allergrootste belang nauwkeurig identificeren filem in het gezonde ruggenmerg maar ook volgen hun lot tijdens pathologische toestanden, degeneratieve ziekten of traumatische letsels van het ruggenmerg. Aangezien filem niet morfologisch verschillen van andere cervicale motorische neuronen, identificatie van filem is afhankelijk van de gerichte levering van neuroanatomische traceurs hetzij op het niveau van primaire respiratoire centra8, of op het middenrif NMJ7 of in de phrenic zenuw4. De tracer is in beslag genomen door de zenuwvezels en droeg tot de phrenic cel organen in de cervicale wervelkolom, waar het kan worden gevisualiseerd met behulp van directe of indirecte detectiesystemen. Retrograad of anterograde verklikstoffen zijn commercieel verkrijgbaar met een brede waaier van geconjugeerde. Opmerkelijk, elke tracer is begiftigd met Nee, lage of hoge capaciteiten voor trans synaptic tracering.
In de huidige studie kozen we de subeenheid van de bèta van het cholera-toxine (CTB) matiemaatschappij met Alexa Fluor 555 (voortaan aangeduid als CTB-fluorophore) als een fluorescerende label, waardoor een directe visualisatie van filem op bevroren ruggenmerg secties. CTB wordt meestal beschreven als een monosynaptic tracer hoewel experimentele gegevens de neiging om te laten zien van een transneuronal passage12. CTB heeft de mogelijkheid om de ganglioside GM1 tijdens het plasma-membraan van de beëindiging van de zenuw binden. BTC is geïnternaliseerd via clathrin-afhankelijke of -onafhankelijke mechanismen en trafieken via de trans-Golgi-netwerk in het endoplasmatisch reticulum in een retrograde mode13,14. De internalisering en retrograde vervoer lijken te zijn afhankelijke op de actine cytoskelet15,16 , alsmede op de microtubuli netwerk17.
Om aan te tonen het nut van CTB als een retrograde neuroanatomische tracer labeling membraan-filem circuits, werd CTB-fluorophore intrapleurally geleverd. CTB werd toegediend gebruikend twee technieken: de eerste opgenomen een laparotomie en meerdere transdiaphragmatic injecties; de tweede, minder invasief, gebruikt een unieke transthoracic injectie. Vier dagen later, fluorescently-label PhMNs werden gekwantificeerd in het cervicale ruggenmerg van gezonde zowel uit spinally-verwonde (C4) dieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hierin beschreven kan worden toegepast op elke stam van volwassen muizen of aan een experimentele paradigma waarin de integriteit van de membraan-filem circuits moet worden geëvalueerd. Amyotrofische laterale sclerose (ALS) en cervicale ruggenmerg letsel (cSCI) zijn bijvoorbeeld voorwaarden in verband met filem verlies, anterograde degeneratie van phrenic axonen en latere respiratoire compromis. Dierlijke modellen ALS of cSCI nabootsen histopathologisch en functionele respiratoire tekorten die worden waarge…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn Robert Graffin en Pauline Duhant dankbaar voor hun technische ondersteuning.
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
Riferimenti
- Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
