Phrenic मोटर न्यूरॉन्स के चूहों में प्रतिगामी Neuroanatomical अनुरेखण
Summary
यहाँ, हम fluorophore संयुग्मित हैजा विष उपइकाई बीटा के intrapleural वितरण के बाद चूहों में phrenic मोटर न्यूरॉन्स की पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. दो तकनीकों फुफ्फुस गुहा सुई की तुलना में कर रहे हैं: transdiaphragmatic बनाम transthoracic दृष्टिकोण ।
Abstract
Phrenic मोटर न्यूरॉन्स ग्रीवा मोटर ंयूरॉंस सबसे स्तनधारी प्रजातियों में C3 से सी 6 के स्तर से उत्पंन कर रहे हैं । Axonal अनुमानों श्वसन डायाफ्राम innervating phrenic नसों में एकाग्र । रीढ़ की हड्डी के स्लाइस में, phrenic मोटर न्यूरॉन्स रूपात्मक या जैव रासायनिक मानदंडों पर अन्य मोटर न्यूरॉन्स से पहचाना नहीं जा सकता. हम phrenic मोटर न्यूरॉन सेल निकायों में चूहों visualizing के लिए प्रक्रियाओं का विवरण प्रदान करते हैं, हैजा विष उपइकाई बीटा के intrapleural इंजेक्शन निम्नलिखित (CTB) एक fluorophore करने के लिए संयुग्मित. इस फ्लोरोसेंट neuroanatomical अनुरेखक को डायाफ्राम neuromuscular जंक्शन पर पकड़ा जा करने की क्षमता है, प्रतिगामी phrenic axons साथ किया जा सकता है और phrenic सेल निकायों तक पहुंचने । intrapleural CTB डिलीवरी के दो methodological दृष्टिकोण की तुलना में हैं: transdiaphragmatic बनाम transthoracic इंजेक्शन । दोनों दृष्टिकोण सफल रहे है और CTB के समान संख्या में परिणाम-phrenic मोटर ंयूरॉंस लेबल । अंत में, इन तकनीकों को कल्पना या इस तरह डायाफ्राम-phrenic सर्किट पर ध्यान केंद्रित उन के रूप में विभिंन प्रायोगिक अध्ययन में phrenic मोटर ंयूरॉंस मात्रा लागू किया जा सकता है ।
Introduction
अध्ययन का उद्देश्य माउस रीढ़ की हड्डी वर्गों पर phrenic मोटर न्यूरॉन्स (PhMN) की पहचान करने के लिए एक विश्वसनीय विधि पेश करने के लिए है. फुफ्फुस गुहा में एक फ्लोरोसेंट neuroanatomical अनुरेखक के इंजेक्शन डायाफ्राम पर phrenic neuromuscular अनुमानों तक पहुँचने और axons सेल निकायों लेबल करने के लिए phrenic phrenic साथ प्रतिगामी परिवहन का उपयोग करने के लिए वितरण विधि के रूप में चुना गया था । intrapleural डिलीवरी की दो तकनीक बताई गई हैं: transdiaphragmatic बनाम transthoracic ।
Phrenic मोटर न्यूरॉन्स रीढ़ रिले कोशिकाओं जिसका axons Phrenic नसों, जो अंततः डायाफ्राम अंदर आना में एकाग्र कर रहे हैं । ये कम मोटर न्यूरॉन्स bulbar श्वसन केंद्रों से inspiratory ड्राइव प्राप्त कर रहे हैं और यह डायाफ्राम न्यूरो पेशी जंक्शनों (NMJ) के लिए रिले । PhMN दो मोटर कॉलम, प्रत्येक hemicord के लिए एक, मध्य ग्रीवा रीढ़ के साथ चल रहा में संरचित कर रहे हैं । मनुष्यों सहित स्तनधारी प्रजातियों में से अधिकांश में, phrenic मोटर कॉलम C3 से सी 6 सी1,2,3के स्तर से फैल गया । हम और दूसरों की पुष्टि की है कि PhMN में ध्यान केंद्रित C3-C5 स्तर में चूहा और माउस रीढ़ की हड्डी में4,5,6,7,8। phrenic कोशिकाओं के स्थलाकृतिक वितरण यादृच्छिक पर नहीं है; मोटर न्यूरॉन्स डायाफ्राम के स्टर्नल हिस्सा innervating phrenic मोटर पूल (C3) के कपाल भाग में और अधिक घनी वितरित कर रहे हैं, जबकि मोटर न्यूरॉन्स innervating crural हिस्सा अधिक caudal (C5)9हैं । इसके अलावा, PhMN ventral सींग ग्रे मामले में विभिंन संकुल रहे हैं । C3 के स्तर पर, phrenic कोशिकाओं के समूहों बाद में झूठ बोलते हैं, तो वे एक ventrolateral दिशा में बदलाव और सबसे caudal स्तर पर ventromedially पाया जाता है10,11.
प्रेरणा के दौरान उनकी महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए, यह अत्यंत महत्व का सही है स्वस्थ रीढ़ की हड्डी में PhMN की पहचान करने के लिए, लेकिन यह भी रोग की स्थिति के दौरान उनके भाग्य का पालन करें, इस तरह के अपक्षयी रोगों या रीढ़ की हड्डी की दर्दनाक चोटों के रूप में । चूंकि PhMN अंय गर्भाशय ग्रीवा मोटर ंयूरॉंस से आकृति विज्ञान अलग नहीं है, PhMN की पहचान neuroanatomical अनुरेखकों के लक्षित वितरण पर निर्भर करता है या तो प्राथमिक श्वसन केंद्रों के स्तर पर 8, या डायाफ्राम NMJ 7 या में phrenic तंत्रिका4। अनुरेखक तंत्रिका तंतुओं द्वारा लिया जाता है और ग्रीवा रीढ़ है, जहां यह प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष जांच प्रणालियों का उपयोग कर visualized किया जा सकता है में phrenic सेल निकायों के लिए किए गए । प्रतिगामी या anterograde अनुरेखकों conjugates की एक व्यापक रेंज के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. ध्यान देने योग्य, प्रत्येक अनुरेखक नहीं, कम या ट्रांस synaptic अनुरेखण के लिए उच्च क्षमताओं के साथ संपंन है ।
वर्तमान अध्ययन में, हम हैजा विष (CTB) Alexa Fluor ५५५ के साथ कार्यात्मक के बीटा उपइकाई चुना (इसके बाद CTB के रूप में निर्दिष्ट-fluorophore) एक फ्लोरोसेंट लेबल के रूप में, जमे हुए रीढ़ की हड्डी के वर्गों पर PhMN का सीधा दृश्य की अनुमति । CTB आमतौर पर एक monosynaptic अनुरेखक के रूप में वर्णित है, हालांकि प्रयोगात्मक डेटा के लिए एक transneuronal गद्यांश12दिखा देते हैं. CTB के पास तंत्रिका को समाप्त करने की प्लाज्मा झिल्ली पर ganglioside GM1 बाँधने की क्षमता है. CTB clathrin-निर्भर या स्वतंत्र तंत्र और यातायात ट्रांस Golgi नेटवर्क के माध्यम से एक प्रतिगामी फैशन में endoplasmic जालिका में13,14के माध्यम से आंतरिक है । internalization और प्रतिगामी परिवहन के लिए actin cytoskeleton15,16 के साथ ही microtubule नेटवर्क पर17पर निर्भर होने लगते हैं ।
एक प्रतिगामी neuroanatomical अनुरेखक लेबलिंग डायाफ्राम-PhMN सर्किट के रूप में CTB की उपयोगिता को प्रदर्शित करने के लिए, CTB-fluorophore intrapleurally दिया गया था. CTB दो तकनीकों का उपयोग कर प्रशासित किया गया था: पहले एक laparotomy और कई transdiaphragmatic इंजेक्शन शामिल; दूसरा एक, कम इनवेसिव, एक अनूठा transthoracic इंजेक्शन का इस्तेमाल किया । चार दिन बाद, फ्लोरोसेंट-लेबल PhMNs से दोनों स्वस्थ और से रीढ़ की हड्डी में ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में quantified थे-घायल (C4) जानवरों ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल वयस्क चूहों के किसी भी तनाव के लिए लागू किया जा सकता है या किसी भी प्रयोगात्मक प्रतिमान जिसमें डायाफ्राम-PhMN सर्किट की अखंडता का मूल्यांकन किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, पेशीशोष?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनके तकनीकी समर्थन के लिए रॉबर्ट Graffin और Pauline Duhant के आभारी हैं ।
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
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