마우스에 인할지 모터 신경의 퇴행 성 신경 해부학 추적
Summary
여기, 우리 intrapleural 배달 fluorophore의 활용 콜레라 독 소 단위 베타 후 쥐에서 인할지 모터 뉴런 식별 프로토콜을 설명 합니다. 흉 막 캐비티 삽입 하 두 기술을 비교: transthoracic 접근 대 transdiaphragmatic.
Abstract
인할지 모터 신경은 자 궁 경부 모터 신경 c 3에서 발생 하는 대부분 포유류 종에서 C6 수준. Axonal 예측 인할지 신경 innervating 호흡기 횡 경 막에 수렴. 척수 조각에서 인할지 모터 뉴런 형태학 또는 생 화 확 적인 기준에 다른 모터 신경에서 확인 될 수 없습니다. 우리 쥐, 콜레라 독 소 단위 베타 (CTB)는 fluorophore를 활용의 다음 intrapleural 주사 인할지 모터 신경 셀 시체를 시각화에 대 한 절차의 설명을 제공 합니다. 이 형광 신경 해부학 추적 횡 경 막 신경 근육 학 교차로에서 잡, 인할지 축 삭을 따라 retrogradely 실시 인할지 셀 시체에 도달 하는 기능이 있다. Intrapleural CTB 배달의 두 방법 론 적 접근 비교: transthoracic 주사 대 transdiaphragmatic. 두 방법 모두 성공 하며 인할지 모터 뉴런 CTB 표시 된의 유사한 수 있습니다. 결론적으로, 이러한 기술은 시각화 또는 다이어 프 램 인할지 회로에 초점을 맞춘 등 다양 한 실험 연구에서 인할지 모터 뉴런 계량에 적용할 수 있습니다.
Introduction
연구의 목표 마우스 척수 섹션에 인할지 모터 신경 (PhMN)를 식별 하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시 하는 것입니다. 흉 막 캐비티에 형광 신경 해부학 추적기의 주입은 횡 경 막에 인할지 신경 근육 학 계획에 도달 하 인할지 축 삭을 따라 역행 전송 인할지 셀 시체를 사용 하 여 전달 방법으로 선정 되었다. Intrapleural 전달의 두 가지 기술을 설명: transthoracic 대 transdiaphragmatic.
인할지 모터 뉴런 누구의 axons 궁극적으로 횡 경 막 자극 인할지 신경으로 수렴 하는 척추 릴레이 셀 있습니다. 이들은 더 낮은 모터 신경 inspiratory 드라이브 안구 호흡기 센터에서 수신 하 고 횡 경 막 신경-근육 접합부 (NMJ) 릴레이. PhMN는 각 hemicord, 중반-자 궁 경부 척추를 따라 실행 한 두 개의 모터 열으로 구성 되어 있습니다. 인간을 포함 한 포유류 종의 대부분, 인할지 모터 열 C61,2,3레벨 c 3에서에서 퍼졌다. 우리와 다른 PhMN 쥐와 쥐 척수4,5,6,,78c 3-c 5 수준에 집중 하는 것을 확인 했습니다. 인할지 셀의 지형 분포 되지 않습니다 무작위로. 모터 뉴런 innervating 횡 경 막의 sternal 부분 crural 부분 innervating 모터 신경은 더 꼬리 (C5)9반면 인할지 모터 풀 (C3)의 두개골 부분에 더 조밀 하 게 배포 됩니다. 또한, PhMN 복 부 경적 회색 문제에 각종으로 클러스터링 됩니다. C3 수준 인할지 셀 클러스터 거짓말 측면, 그때 그들은 ventrolateral 방향에서 이동 하 고 ventromedially는 가장 꼬리 레벨10,11에서 찾을 수 있습니다.
영감 중 그들의 중요 한 역할을 감안할 때, 그것 건강 한 척수에서 PhMN를 정확 하 게 식별 하지만 또한 퇴행 성 질환 또는 척수의 외상 성 상해 등 병 적인 상태에 있는 동안 그들의 운명에 따라 매우 중요입니다. 때문에 PhMN 차이가 없습니다 형태학 상으로 다른 자 궁 경부 모터 신경에서 PhMN의 주 호흡기 센터8또는 격 막 NMJ7 또는 수준에서 신경 해부학 추적기의 대상된 배달에 의존 인할지 신경4. 추적 프로그램 신경 섬유에 의해 촬영 및 자 궁 경부 척추에 인할지 셀 시체까지 수행 어디에 직접 또는 간접 검출 시스템을 사용 하 여 구상 될 수 있다. 역행 또는 참가자 추적기 어원이 같은 말의 광범위 한 범위와 상업적으로 사용할 수 있습니다. 각 추적 부여 없이, 주목할 만한, trans 시 냅 스 추적에 대 한 낮은 또는 높은 능력.
현재 연구에서 우리가 선택 했다 콜레라 독 소 (CTB) 알 렉 사 Fluor 555 (이제부터 CTB fluorophore 라고도 함)와 공업화의 beta 소 단위 형광 라벨으로 냉동된 척수 섹션에 PhMN의 직접적인 시각화 수 있도록. CTB는 실험 데이터는 transneuronal 통로12를 표시 하는 경향이 있지만 일반적으로 monosynaptic 추적 프로그램 설명. CTB은 ganglioside GM1 신경 결말의 원형질 막에 바인딩할 수가 있습니다. CTB는 역행 패션13,14에서 바인딩과 그물에 clathrin-또는-독립적인 메커니즘 및 trans Golgi 네트워크를 통해 트래픽을 통해 내 면. 국제화와 역행 전송 microtubule 네트워크17에 뿐만 아니라 말라 골격15,16 에 종속 될 것 같다.
퇴행 성 신경 해부학 추적 프로그램 다이어 프 램 PhMN 회로 라벨로 CTB의 유용성을 입증, CTB fluorophore intrapleurally는 전달 했다. CTB 두 가지 기법을 사용 하 여 관리 했다: 첫 번째 포함는 개복 술과 여러 transdiaphragmatic 주사; 번째, 보다 적게 침략 적, 독특한 transthoracic 주사를 사용합니다. 4 일 후, 붙일 레이블 PhMNs에서 건강에서 그리고 spinally 부상 (C4) 동물에서 경부 척수에 정량 했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성인 쥐의 어떤 긴장 든 지 또는 어떤 실험 패러다임 다이어 프 램 PhMN 회로의 무결성을 평가 해야 되 여기에 설명 된 프로토콜을 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 루 경화 증 (ALS) 및 자 궁 경관 척수 상해 (cSCI) PhMN 손실, 인할지 축 삭 및 후속 호흡 타협의 참가자 퇴보와 관련 된 조건들이 있습니다. ALS 또는 cSCI의 동물 모델 histopathological와 기능 호흡 적자 인간의 질병에서 관찰 모방. 이러한 모델에?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 기술 지원에 대 한 로버트 Graffin, 폴 Duhant에 감사입니다.
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
Riferimenti
- Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
