Retrograd nevroanatomi sporing av Phrenic Motor Neurons i mus
Summary
Her beskriver vi en protokoll for å identifisere phrenic motor neurons i mus etter intrapleural levering av fluorophore konjugert kolera gift delenhet beta. To teknikker sammenlignes for å injisere pleural hulrommet: transdiaphragmatic versus transthoracic tilnærminger.
Abstract
Phrenic motor neurons er cervical motor neurons stammer fra C3 C6 nivåer i mest pattedyrarter. Axonal anslag konvergere i phrenic nerver innervating åndedrettsorganene membranen. I ryggmargen skiver, kan ikke phrenic motor neurons identifiseres fra andre motor neurons på morfologiske eller biokjemiske kriterier. Vi gir en beskrivelse av prosedyrer for å visualisere phrenic motor neuron cellen legemer i mus, følgende intrapleural injeksjoner av kolera gift delenhet beta (CTB) konjugert til en fluorophore. Denne fluorescerende nevroanatomi tracer har muligheten til å bli fanget i membran nevromuskulær krysset, utføres retrogradely langs phrenic axons og nå de phrenic cellen legemer. To metodologiske tilnærmingsmåter intrapleural CTB levering sammenlignes: transdiaphragmatic versus transthoracic injeksjoner. Begge tilnærminger er vellykket og tilsvarende antall CTB-merket phrenic motor neurons. Avslutningsvis kan disse teknikkene brukes for å visualisere eller kvantifisere phrenic motor neurons i ulike eksperimentelle studier som de fokusert på membran-phrenic kretsene.
Introduction
Målet med undersøkelsen er å presentere en pålitelig metode for å identifisere phrenic motor neurons (PhMN) på musen ryggmargen deler. Injeksjon av en fluorescerende nevroanatomi tracer i pleural hulrom ble valgt som leveringsmåte å nå de phrenic nevromuskulær anslagene til membranen og bruke retrograd transport langs phrenic axons for å merke phrenic cellen legemer. To teknikker for intrapleural levering er beskrevet: transdiaphragmatic mot transthoracic.
Phrenic motor neurons er spinal relé celler som axons konvergere i phrenic nerver, som til slutt innervate mellomgulvet. Dette er lavere motor neurons mottar Inspiratorisk stasjonen fra bulbar åndedretts sentrene og formidle dem til membran Nevro-muskulære veikryss (NMJ). PhMN er strukturert i to motor kolonner, en for hver hemicord, kjører langs midten av cervikal ryggraden. I de fleste pattedyrarter, inkludert mennesker, spre phrenic motor kolonnene fra nivåer C3 C61,2,3. Vi og andre har bekreftet at PhMN konsentrert i C3-C5 nivåer i rotte og mus ryggmargen4,5,6,7,8. Topografiske distribusjon av phrenic celler er ikke tilfeldig; motor neurons innervating den sternal delen av mellomgulvet distribueres mer tett i skallen del av phrenic motoren bassenget (C3), mens motor neurons innervating delen crural er mer caudal (C5)9. Videre PhMN klynger vekslet i ventral horn grå materie. På C3 nivå, i klynger av phrenic celler ligger lateralt, så de skifte i en ventrolateral retning og finnes ventromedially på mest caudal nivåer10,11.
Gitt deres avgjørende rolle under inspirasjon, er det av største viktighet å nøyaktig identifisere PhMN i sunn ryggmargen, men også følge deres skjebne under pathological betingelser, for eksempel degenerative sykdommer eller traumatisk skader i ryggmargen. Siden PhMN ikke avviker morphologically fra andre cervical motor neurons, identifikasjon av PhMN er avhengig av målrettet levering av nevroanatomi tracers enten på nivået av primære åndedretts sentre8, eller på membran NMJ7 eller i phrenic nerve4. Tracer opptas av nervefibrene og fraktet til phrenic cellen legemer i cervical ryggraden, der det kan visualiseres ved hjelp av direkte eller indirekte oppdagingssystemer. Retrograde eller anterograd tracers er kommersielt tilgjengelig med et bredt spekter av conjugates. Merke, hver tracer er utstyrt med nei, lav eller høy evner for trans synaptic sporing.
I denne studien valgte vi beta delenhet i kolera giften (CTB) functionalized med Alexa Fluor 555 (heretter referert til som CTB-fluorophore) som en fluorescerende etikett, slik at en direkte visualisering av PhMN på frosne ryggmargen deler. CTB er vanligvis beskrevet som en monosynaptic tracer selv om eksperimentelle data har tendens til viser en transneuronal passasjen12. CTB har evnen å binde ganglioside GM1 plasma membranen av nerve slutt. CTB er internalisert via clathrin-avhengige eller -uavhengig mekanismer og trafikker gjennom trans-Golgi nettverket i det endoplasmatiske retikulum i en retrograd mote13,14. Internalisering og retrograd transport synes å være avhengig på utgangen cytoskjelett15,16 og de microtubule nettverk17.
For å demonstrere nytten av CTB som en retrograd nevroanatomi tracer merking membran-PhMN krets, ble CTB-fluorophore levert intrapleurally. CTB ble administrert bruker to teknikker: den første som inkluderte en laparotomy og flere transdiaphragmatic injeksjoner; den andre en, mindre invasiv, brukes en unik transthoracic injeksjon. Fire dager senere, fluorescently-merket PhMNs kvantifisert i cervical ryggmargen fra både fra sunn og spinally skadet (C4) dyr.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her kan brukes å belastning av voksen mus eller noen eksperimentelle paradigme der integriteten av membran-PhMN kretsene bør vurderes. For eksempel, er amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og cervical ryggmargsskade (cSCI) betingelser knyttet PhMN tap, anterograd degenerasjon av phrenic axons og påfølgende åndedretts kompromiss. Dyremodeller ALS eller cSCI etterligner histopathological og funksjonelle åndedretts underskudd i menneskelige sykdommer. I disse modellene, er histologiske teknikker of…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for Robert Graffin og Pauline Duhant deres kundestøtte.
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
Riferimenti
- Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
