Ретроградная нейроанатомический трассировки диафрагмальный двигательных нейронов у мышей
Summary
Здесь мы описываем протокол для выявления диафрагмальный двигательных нейронов в мышей после доставки внутриплевральной Флюорофор конъюгированных бета Субблок токсинов холеры. Придать плевральной полости сравниваются две техники: transdiaphragmatic против Трансторакальная подходов.
Abstract
Диафрагмальный моторные нейроны являются шейки матки двигательных нейронов, возникая от C3, C6 уровни в наиболее млекопитающих. Аксональное прогнозы сходятся в диафрагмального нервов, иннервирующих дыхательной диафрагмы. В спинном ломтиками диафрагмальный моторные нейроны нельзя определить от других двигательных нейронов на морфологические и биохимические критерии. Мы предоставляем описание процедур для визуализации диафрагмальный мотонейрона клеток органов мышей, следующей инъекции внутриплевральной холеры бета Субблок токсин (СТВ) проспряганное Флюорофор. Этот флуоресцентные нейроанатомический трассирующими имеет возможность догнал на стыке нервно диафрагмы, перевозиться retrogradely вдоль диафрагмальный аксонов и достичь диафрагмальный клеток тела. Сравниваются два методологических подходов внутриплевральной CTB доставки: transdiaphragmatic против Трансторакальная инъекции. Оба подхода являются успешными и привести к аналогичное количество CTB-меченых диафрагмальный двигательных нейронов. В заключение эти методы могут применяться для визуализации или количественно диафрагмальный двигательных нейронов в различных экспериментальных исследований, таких как тех, сосредоточены на Диафрагма диафрагмального схемы.
Introduction
Цель исследования заключается в представлении надежный метод идентификации диафрагмальный двигательных нейронов (PhMN) на мышь спинной секции. Инъекции флуоресцентные нейроанатомический трассировщика в плевральной полости был выбран в качестве метода доставки достичь диафрагмальный нервно проекции на диафрагму и использовать Ретроградная транспорта вдоль диафрагмальный аксоны маркировать диафрагмальный клеток органов. Описаны два способа доставки внутриплевральной: transdiaphragmatic против трансторакальный.
Диафрагмальный моторные нейроны являются клетки спинного реле, чьи аксонов сходятся в диафрагмального нервов, которые в конечном итоге иннервируют диафрагмы. Это Нижняя моторные нейроны получают вдоха езды от бульбарной дыхательных центров и ретрансляции для диафрагмы нейро мышечной развязок (NMJ). PhMN структурированы в мотор две колонки, одна для каждого hemicord, идущую вдоль середины шейного отдела позвоночника. В большинстве видов млекопитающих, включая человека диафрагмальный мотор столбцы распространилась от уровней C3 С61,2,3. Мы и другие подтвердили, что PhMN в основном в С3-С5 уровнях в крысы и мыши спинного4,5,6,,7,8. Топографический распределение диафрагмальный клеток не является случайным; двигательных нейронов, иннервирующих грудная часть диафрагмы распределяются более плотно в черепной части диафрагмальный автопарк (С3), тогда как моторные нейроны, иннервирующих части голеней являются более хвостового (C5)9. Кроме того PhMN сгруппированы различно в вентральной Рог серого вещества. На уровне С3 кластеры диафрагмальный клетки лежат сбоку, то они сдвиг в направлении, вентролатеральной и ventromedially, находятся в наиболее хвостового уровней10,11.
Учитывая их жизненно важную роль во вдохновение, это крайне важно точно определить PhMN в спинной мозг здорового, но также следить за их судьбу в ходе патологических состояний, таких как дегенеративных заболеваний или травм спинного мозга. Так как PhMN не морфологически отличаются от других шейки матки двигательных нейронов, выявление PhMN опирается на адресности нейроанатомический Трейсеры либо на уровне первичной дыхательных центров8, или в Диафрагма NMJ7 или в диафрагмальный нерв4. Трассировщик принятые нервных волокон и осуществляется до диафрагмальный клеток тела в шейном отделе позвоночника, где могут быть визуализированы с помощью систем прямого или косвенного обнаружения. Антероградная Трейсеры коммерчески доступны с широким спектром конъюгаты или ретроградной. Примечательно, каждый трассирующими наделен нет, низкой или высокой способности для транс синаптических трассировки.
В текущем исследовании мы выбрали бета Субблок холеры токсин (СТВ) функционализированных с Alexa 555 Fluor (далее CTB-Флюорофор) как флуоресцентные метки, позволяя прямой визуализации PhMN на замороженных спинной секции. CTB обычно описывается как трассировщик monosynaptic хотя экспериментальных данных, как правило, чтобы показать transneuronal проход12. CTB обладает способностью связывать Ганглиозиды GM1 на плазматической мембране нервные окончания. CTB включены через Клатрин зависимые или – независимые механизмы и трафика через сеть транс Гольджи в эндоплазматический ретикулум в ретроградное мода13,14. Ретроградная транспорта и интернализации, как представляется, зависит от Цитоскелет актина,15,,16 , а также сети микротрубочек17.
Чтобы продемонстрировать полезность ДВЗИ как Ретроградная нейроанатомический трассирующими маркировки диафрагма PhMN схема, СТВ Флюорофор было поставлено intrapleurally. CTB осуществлялось с помощью двух методов: первая включала лапаротомии и несколько transdiaphragmatic инъекции; Вторая, менее инвазивные, используется уникальный Трансторакальная инъекции. Четыре дня спустя, дневно меченых PhMNs были количественно оценены в шейного отдела спинного от обоих из здоровых и spinally povrejdennyx животных (C4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанные здесь, могут применяться к любой штамм взрослых мышей или любой экспериментальной парадигмы, в котором должны оцениваться целостности цепи диафрагма PhMN. К примеру боковой амиотрофический склероз (ALS) и травмы шейного отдела спинного (cSCI) являются условия, связанные ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Роберт Граффин и Полин Duhant за их техническую поддержку.
Materials
| Glass-bead sterilizer Steri 250 | Keller | 31-101 | |
| Small scissors | F.S.T. | 14058-00 | |
| Soft tweezers | F.S.T. | 11042-08 | |
| Scalpel blades | Swann Morton | No.11 or 15 | |
| Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555 | Life Technologies | C22843 | Bring at room temperature before use |
| 10ul Hamilton syringue, removable needle | Sigma-Aldrich | 701RN | |
| 33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4 | Filter Service | 7803-05 | |
| 500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge | Terumo | BS05M2713 | |
| Orientable LED lamp | V.W.R. | 631-0995 | |
| Resorbable 4/0 sutures | S.M.I. AG | 15151519 | |
| Needle holder | F.S.T. | 12002-14 | |
| 9mm autoclips | Bioseb | 205016 | |
| Autoclip 9mm applier | Bioseb | MikRon 9mm |
Riferimenti
- Webber, C. L., Wurster, R. D., Chung, J. M. Cat phrenic nucleus architecture as revealed by horseradish peroxidase mapping. Exp Brain Res. 35 (3), 395-406 (1979).
- Goshgarian, H. G., Rafols, J. A. The phrenic nucleus of the albino rat: a correlative HRP and Golgi study. J Comp Neurol. 201 (3), 441-456 (1981).
- Gordon, D. C., Richmond, F. J. Topography in the phrenic motoneuron nucleus demonstrated by retrograde multiple-labelling techniques. J Comp Neurol. 292 (3), 424-434 (1990).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Retrograde labeling of phrenic motoneurons by intrapleural injection. J Neurosci Methods. 182 (2), 244-249 (2009).
- Nicaise, C., et al. Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion. J Neurotrauma. 30 (12), 1092-1099 (2013).
- Nicaise, C., et al. Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury. Exp Neurol. 235 (2), 539-552 (2012).
- Nicaise, C., et al. Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice. J Neurotrauma. 29 (18), 2748-2760 (2012).
- Qiu, K., Lane, M. A., Lee, K. Z., Reier, P. J., Fuller, D. D. The phrenic motor nucleus in the adult mouse. Exp Neurol. 226 (1), 254-258 (2010).
- Laskowski, M. B., Sanes, J. R. Topographic mapping of motor pools onto skeletal muscles. J Neurosci. 7 (1), 252-260 (1987).
- Feldman, J. L., Loewy, A. D., Speck, D. F. Projections from the ventral respiratory group to phrenic and intercostal motoneurons in cat: an autoradiographic study. J Neurosci. 5 (8), 1993-2000 (1985).
- Gottschall, J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muscle fiber composition; perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol (Berl). 161 (4), 405-417 (1981).
- Lai, B. Q., et al. Cholera Toxin B Subunit Shows Transneuronal Tracing after Injection in an Injured Sciatic Nerve. PLoS One. 10 (12), e0144030 (2015).
- Torgersen, M. L., Skretting, G., van Deurs, B., Sandvig, K. Internalization of cholera toxin by different endocytic mechanisms. J Cell Sci. 114 (Pt 20), 3737-3747 (2001).
- Chinnapen, D. J., Chinnapen, H., Saslowsky, D., Lencer, W. I. Rafting with cholera toxin: endocytosis and trafficking from plasma membrane to ER. FEMS Microbiol Lett. 266 (2), 129-137 (2007).
- Fujinaga, Y., et al. Gangliosides that associate with lipid rafts mediate transport of cholera and related toxins from the plasma membrane to endoplasmic reticulm. Mol Biol Cell. 14 (12), 4783-4793 (2003).
- Badizadegan, K., Wheeler, H. E., Fujinaga, Y., Lencer, W. I. Trafficking of cholera toxin-ganglioside GM1 complex into Golgi and induction of toxicity depend on actin cytoskeleton. Am J Physiol Cell Physiol. 287 (5), C1453-C1462 (2004).
- Abbott, C. J., et al. Imaging axonal transport in the rat visual pathway. Biomed Opt Express. 4 (2), 364-386 (2013).
- Li, K., et al. Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury. J Neurosci. 34 (22), 7622-7638 (2014).
- Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
- Llado, J., et al. Degeneration of respiratory motor neurons in the SOD1 G93A transgenic rat model of ALS. Neurobiol Dis. 21 (1), 110-118 (2006).
- Lepore, A. C., et al. Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease. Nat Neurosci. 11 (11), 1294-1301 (2008).
- Sieck, G. C., Fournier, M. Diaphragm motor unit recruitment during ventilatory and nonventilatory behaviors. J Appl Physiol. 66 (6), 2539-2545 (1989).
- Janicot, M., Clot, J. P., Desbuquois, B. Interactions of cholera toxin with isolated hepatocytes. Effects of low pH, chloroquine and monensin on toxin internalization, processing and action. Biochem J. 253 (3), 735-743 (1988).
