En Vivo Control de la expresión de genes del reloj circadiano en el núcleo supraquiasmático de ratón usando fluorescencia Reporteros
Summary
Esta nueva tecnología basada en la fluorescencia permite la monitorización a largo plazo de la transcripción de los genes del reloj circadiano en el núcleo supraquiasmático (SCN) de mover libremente ratones en tiempo real y con una alta resolución temporal.
Abstract
Esta técnica combina la fibra óptica mediada fluorescencia grabaciones con la entrega exacta de virus adeno-asociado recombinante basado en genes reporteros. Este nuevo y fácil de usar en vivo fluorescencia sistema de monitoreo fue desarrollado para grabar el ritmo transcripcional del gen reloj, Cry1, en el núcleo supraquiasmático (SCN) de la mudanza libremente ratones. Para ello, un reportero de fluorescencia Cry1 transcripción fue diseñado y empaquetado en virus Adeno-asociado. Virus purificado, concentrado fue inyectado en el ratón SCN seguido por la inserción de una fibra óptica, que luego se fija sobre la superficie del cerebro. Los animales fueron devueltos a sus jaulas hogar y permite un período de recuperación postoperatorio 1 mes asegurar suficiente expresión de reportero. La fluorescencia entonces se registró en libremente mover ratones vía un en vivo Monitoreo sistema que fue construido en nuestra institución. Para el en vivo sistema de grabación, a 488 nm láser fue juntada con un 1 x 4-divisor de viga que divide la luz en cuatro salidas de excitación láser de igual potencia. Esta configuración nos permitió grabar en cuatro animales simultáneamente. Cada una de las señales de fluorescencia emitida fue recogida a través de un tubo fotomultiplicador y una tarjeta de adquisición de datos. En contraste con la técnica de bioluminiscencia anterior en vivo grabación reloj circadiano, esta fluorescencia en vivo sistema de grabación que permite la grabación de la expresión de genes del reloj circadiano durante el ciclo de luz.
Introduction
En los mamíferos, el núcleo supraquiasmático (SCN) gobierna del ritmo circadiano del cuerpo entero para coordinar la respuesta de un individuo a los cambios ambientales exógenos (p. ej., luz, temperatura, estrés, etc.)1. Base reloj componentes consisten en Per1-3, 2 Cry1, Clocky Bmal1y desempeñan un papel central en la regulación del reloj circadiano de cada célula. Cada célula en el SCN contiene el activador transcripcional, reloj/BMAL1, que actúa como un heterodímero para inducir la expresión de por y grito. PER / grito complejo entonces inhibe la función de reloj/BMAL1 para formar un lazo de regeneración de transcripción-traducción que lleva alrededor de 24 h a completa2,3.
Estudios previos en el SCN han empleado principalmente el ex vivo SCN rebanada cultura método4,5,6 y, aunque este enfoque ha proporcionado información valiosa, sus limitaciones han inhibido nuestra capacidad de obtener datos con respecto a la influencia de otros núcleos del cerebro en el SCN, así como el efecto de estímulos exógenos (e.g., luz) en las células que residen en esta región crítica. En 2001, el grupo de Hitoshi Okamura fue el primero en utilizar el sistema de bioluminiscencia en vivo expresión génica monitor reloj circadiano en el SCN en el libre movimiento de ratones7. Grupo de Ken-ichi Honma ha pasado los últimos años desarrollando la bioluminiscencia en vivo sistema de grabación en el SCN8,9,10. Juntos, estos estudios han proporcionado a los investigadores con la capacidad para monitorear el reloj circadiano en constante oscuridad o después de un pulso de luz. Sin embargo, debido a bioluminescence es demasiado débil para permitir la monitorización continua durante el ciclo de luz/oscuridad, junto con el hecho de que la luz es la señal predominante para el arrastre de SCN-mediada de relojes circadianos11, hay aumento de la demanda para el desarrollo de métodos experimentales que superar las limitaciones asociadas con la grabación de la bioluminiscencia. El actual informe describe un sistema basado en la fluorescencia que se construyó para vigilar el reloj circadiano de la SCN en vivo libremente mover ratones. Este método fácil de usar permite monitoreo continuo durante el ciclo de luz/oscuridad y permite la observación a largo plazo de la transcripción de los genes del reloj circadiano en la escena en tiempo real y con alta resolución temporal.
Protocol
Representative Results
Discussion
En contraste con métodos ex vivo , como sector cultura4,5, RT-PCR16y en situ hibridación17, que mató a los animales, el en vivo método de grabación permite investigadores para el estudio de expresión de genes circadianos en un animal vivo. Así, esta tecnología proporciona la capacidad para evaluar el efecto de diferentes perturbaciones físicas (p. ej., privación del sue?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros en el laboratorio de Zhang para proporcionar estimulantes discusiones y miembros en el laboratorio de Zhan para asistencia técnica. Esta investigación fue apoyada por concesiones 31500860 (a C.Z.) de la NSFC, 2012CB837700 (y E.E.Z. C.Z.) del programa 973 de M.O.S.T. de China y por fondos del Gobierno Municipal de Beijing. E.E.Z. fue apoyado por los chinos “Programa de reclutamiento de expertos de Juventud Global”.
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
Riferimenti
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
