환자에서 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립

Summary

다음 프로토콜 환자 파생 된 연 조직 육 종 (STS)의 주 문화는의 설립에 집중 한다. 이 모델 분자 배경 및 약리 프로필 이러한 드문 악성 종양의 더 나은 이해를 우리를 도울 수 및 STS 관리를 개선 하기 위한 추가 연구에 대 한 출발점을 대표할 수 있었다.

Abstract

연 조직 sarcomas (STS) 어려운 진단, 분류 및 관리와 함께 다른 유형의 악성의 스펙트럼을 나타냅니다. 날짜 하려면,이 드문 단단한 종양의 50 이상 조직학 하위 확인 되었습니다. 따라서, 그들의 특별 한 다양성 및 낮은 발병 률,이 종양의 생물학의 우리의 이해 여전히 제한 됩니다. 환자 파생 문화 STS 이상과 약리학 연구에 이상적인 플랫폼을 나타냅니다. 우리는 따라서 종양 표본을 외과 절제술을 받은 환자에서가 걷이에서 시작 하는 STS의는 인간의 전 임상 모델을 개발 했다. STS 세포 배양 환자 파생 콜라 소화에 의해 수술 표본에서 얻은 고 여과 의해 분리. 셀 계산, 시드, 그리고 표준 단층 문화에서 14 일에 대 한 되었고 다운스트림 분석 처리. 분자 또는 제약 분석을 수행 하기 전에 STS 주 문화의 설립 cytomorphologic 기능, 그리고 가능한 경우, 평가 통해 확인 되었다 immunohistochemical 마커. 이 메서드는 1)이 제대로 탐험된 악성의 자연의 역사를 공부 하 고 2) 그들의 행동의 메커니즘에 대 한 자세한 노력에 다른 약물의 효과 테스트 하는 유용한 도구를 나타냅니다.

Introduction

모든 고체 종양^1,2, 1%에 대 한 간 엽 기원 회계의 이질적인 장애의 스펙트럼을 포함 하는 부드러운 조직 sarcomas (STS) 그리고 이상의 50의 존재를 인식 하는 새로운 세계 보건 기구 분류 다른 하위³. 이 중, 가장 일반적인 histotypes 있으며 체형 육 종 또는 liposarcoma leiomyosarcoma, 15%와 모든 성인 STS, 각각^4,5의 11%를 차지. STS는 신체의 다른 부분에서 개발할 수 있습니다, 비록 사지 그리고 retroperitoneum 60%와 20%의 경우, 각각⁶에서 발생 하는 가장 일반적인 사이트는.

지역화 된 질병에 대 한 치료의 초석은 넓은 외과 절제술, 보조 및 neoadjuvant 요법의 혜택은 아직 명확 하지 않다 고⁷선택 된 경우만 간주 됩니다. 전이성 설정에서 화학 요법 치료의 표준 이지만 제한 된 결과⁸를 보여줍니다. STS의 분자 생물학의 더 나은 이해는 현재 차별 진단 개선, 사용 가능한 치료를 최적화 하 고 치료를 위한 새로운 표적 식별에 도움이 될.

이 컨텍스트 내에서 불멸 하 게 셀 라인⁹를 사용 하 여 몇 년 동안 암에 대 한 연구를 수행 하고있다. 이러한 실험 모델 일반적으로 표준 단층 지원에 배양 또는 vivo에서 이 종이 식¹⁰모델 확립 immunodeficient 설치류에 이식. 불멸 하 게 셀 라인 관리 및 매장이 쉬운 자료를는 연구 실험의 충분 한 번호를 수행할 수 있습니다 나타냅니다. 그들은, 실제로, 가장 저렴 하 고 가장 널리 전 임상 연구¹¹에 도구를 사용.

그러나, 셀 라인 기반 암 모델도 몇 가지 제한이, 구절의 증가 함께 단층 시스템에서 예: 연장 문화 유도 phenotypic 및 유전적 부동, 만들기에 정리 주요 종양을 적은 셀 기능입니다. 또한, 셀 라인 문화 셀 상호 작용 및 신호 분자 크로스 토크는 종양의 생물 학적 행동을 모방 하 고 종양 microenvironment 특성화를 재현 하지. 이러한 문제는 전 임상 및 임상 결과¹²사이 기존 하는 격차의 기초를 형성 합니다.

위의 감안할 때, 환자 파생 주 문화에 관심^13을증가 했다. 실제로, 악성과 정상적인 직물의 절단 암 세포 표현 형 및 따라서 종양 microenvironment의 대표는 시작 물자를 제공 하 고이 잃기의 위험을 줄여줍니다. 또한, 외과 절제술을 받은 환자에서 수확 한 신선한 종양 견본의 사용 단일 종양을 조사 하 고 다른 병 변 환자의 몸¹⁴의 동일한 부분에서 비교 하 있습니다. 위의 이유로 조직 파생 셀 문화 종양 이상과 약리학^15,16,17, 특히 어떤 상용 육 종 세포 라인에 STS를 연구 하는 귀중 한 자료를 제공 제한 된¹⁸있습니다. 우리는 따라서 환자 파생 STS 1 차 셀 문화 수술 삭제 종양 조직^13,,1920에서 시작을 설정 하는 방법을 최적화 합니다. 우리의 방법 뒤에 단일 세포 현 탁 액을 얻기 위해 하룻밤 효소 조직 분리 하는 작은 조직 조각으로 종양 견본 disaggregating 이루어져 있다. 다음 날, 효소 소화 신선한 문화 미디어를 추가 하 여 중지 되 고 얻은 서 스 펜 션 조직 파편, 셀 집계 및 초과 매트릭스 또는 파편을 제거 하도록 필터링 됩니다. 마지막으로, 격리 된 종양 세포의 일부분은 유리 슬라이드, 고정 및 cytomorphological, immunohistochemical 및 분자 cytogenetic 평가 STS 주 문화 설립을 확인 하기 위한 다운스트림 분석에 대 한 저장에 cytospinned (MDM2 증폭의예: 물고기 분석이 나타냅니다 잘 차별화 liposarcoma 및 dedifferentiated liposarcoma 표준 차별 진단을) ⁴. 나머지는 유전자 식 프로 파일링 및 약리 연구에 대 한 표준 단층 문화로 시드. 실험 낮은 사용 하 여 수행 됩니다 모든 구절을 피하기 위해 특정 암 subclones의 선택 주 문화 그리고 경험된 육 병리학 자에 의해 분석. 우리는 완전히 인간 STS ex vivo 모델^13,19,20를 따라서 만들었습니다. 이 높게 다재 다능 한, 쉽게 핸들 모델의 전 임상 연구, 예를 들어 진단 및 예 후에 대 한 새로운 분자 마커를 식별 하거나 활동의 깊은 이해 및 메커니즘의 종류에 대 한 유용한 도구를 나타낼 수 STS의 관리에 사용 되는 표준 및 새로운 약물의 액션.

Protocol

STS 세포 대량 수술 환자 STS에서에서 excised 종양 으로부터 격리 됩니다. 프로토콜 로컬 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다 하 고 좋은 임상 연습 가이드라인과 헬싱키 선언에 따라 수행 됩니다. 모든 환자는 연구에 참여 하는 것 서 면된 동의 했다. 수술 표본 경험된 육 병리학 자에 의해 분석 하 고 수술의 3 시간 이내에 처리 됩니다. 1. 종양 표본 수집 및 처리: DMEM 낮?…

Representative Results

우리 설계 환자 파생 된 연 조직 육 종의 기본 문화 설립 여기 한 특정 STS histotype13에서 얻은 결과의 예를 보고 하는 간단한 방법. 프로토콜, 잘 분화 liposarcoma를 포함 하 여 다른 STS histotypes의 기본 문화의 설립을 위해 사용 되었다 liposarcoma, myxoid liposarcoma, pleomorphic liposarcoma, myxofibrosarcoma, undifferentiated dedifferentiated pleomorphic 육 종, 요점, 및 desmoid fibromatosis입?…

Discussion

잘 정의 된 전 임상 모델 종양의 분자 배경 명료, 가난한 예 후를 예측 하 고 암 환자에 대 한 새로운 치료 전략을 개발 필요 합니다. 이것은 특히 STS 등 희귀 한 종양에 대 한 중요 한 형태에서 그 높은, 공격적인 잠재적인, 및 임상 행동 STS 생물학 및 환자 관리²¹의 우리의 이해에 도전. 또한, 사용할 수 있는 몇 가지 상업 육 종 셀 라인 엽 종양¹⁸의이 그룹에 대 한 …

Materials

DMEM High Glucose	EuroClone	ECB7501L
Fetal bovine serum	EuroClone	ECS0180D
Glutamine	Gibco	25030-024
Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade	Electron Microscopy Sciences	157-4-100
Penicillin streptomycin	Gibco	15140122
Triazol reagent	Ambion Life-Technologies	15596018
Trypsin	EuroClone	ECB3052D