Een eenvoudige en goedkope Assay voor het meten van Ambulation in muismodellen van spierdystrofie
Summary
Dit protocol beschrijft een flexibele, voordelige systeem voor het meten van de muis ambulation in een open veld activiteit assay. We laten zien dat een bepaling van de 6 minuten durende ambulation op basis van dit systeem een afname van de vrijwillige beweging in mdx muizen detecteert en nauwkeurig verbetering in een spier-specifieke redding van deze dieren onderscheidt.
Abstract
Het meten van functionele resultaten bij de behandeling van spierdystrofie is een wezenlijk aspect van de preklinische testen. De beoordeling van vrijwillige ambulation in muismodellen is een niet-invasieve en reproduceerbare activiteit-test die is direct analoog aan maatregelen van patiënt ambulation zoals de 6-minuten-test en gerelateerde mobiliteit scores. Vele gemeenschappelijke methoden voor het testen van de muis ambulation snelheid en afstand zijn gebaseerd op het open veldtest, waar het dier vrij verkeer binnen een arena wordt gemeten na verloop van tijd. Een groot nadeel aan deze benadering is dat commerciële software en apparatuur voor hoge resolutie volgen van beweging is duur en mogelijk overbrengen van muizen tot gespecialiseerde faciliteiten voor het testen. Hier beschrijven we een goedkope, video-gebaseerd systeem voor het meten van de muis ambulation dat gebruik maakt van gratis en open-source software. Met behulp van dit protocol, we laten zien dat vrijwillige ambulation in het Dystrofine-lege mdx -muismodel voor Duchenne muscular dystrophy (DMD) is gedaald ten opzichte van de wild-type muis activiteit. In mdx uiting geven aan de utrophin transgenic muizen deze activiteit tekorten niet worden nageleefd en de totale afgelegde afstand is niet te onderscheiden van muizen wild-type. Deze methode is effectief voor het meten van veranderingen in vrijwillige ambulation Dystrofe pathologie is gekoppeld, en biedt een veelzijdig platform dat gemakkelijk kan worden aangepast aan uiteenlopende onderzoek instellingen.
Introduction
Betrouwbare en reproduceerbare metingen van spier functie zijn van cruciaal belang voor de beoordeling van de werkzaamheid van potentiële therapieën voor DMD. DMD is een genetische aandoening veroorzaakt door mutaties in het Dystrofine-gen, leidt tot progressieve spierzwakte, verlies van ambulation, en uiteindelijke Cardiorespiratoire mislukking. De meest gebruikte diermodel van DMD is het Dystrofine-lege mdx -muis. Een batterij van functionele tests opgedoken als routine tests voor de beoordeling van de progressie van de ziekte in de mdx -muis zo goed zoals in soortgelijke dierlijke modellen van andere dystrophie en myopathieën. Veelgebruikte in vivo tests omvatten metingen van de voorpoot grijpkracht, draad, tijd, rotarod maximum, tijd opknoping aan uitputting tijdens loopband uitgevoerd, en motorische activiteit bijhouden. Er is een aanzienlijke inspanning op het gebied op de standaardisering van deze tests, met als doel vermindering van de variabiliteit tussen de preklinische studies en verhogen het translationeel potentieel van therapeutics getest in muizen1,2.
Een belangrijke categorie van preklinische testen is het meten van vrijwillige beweging, een parameter die vaak wordt gewijzigd in lymfkliertest modellen van spierdystrofie. Dit wordt meestal getest door te testen op basis van het open veld Activiteitencontrole, en kan horizontaal (lopen) of verticale (kweek) bewegingen in een loop van minuten of uren2,3,4te evalueren. Een aantal studies is gebleken dat vrijwillige beweging moet worden gewijzigd in mdx muizen, vooral na het sporten, en deze metingen is gebleken te zijn gevoelig voor behandeling en ziekte progressie van de drug. Een belangrijke beperking bij het uitvoeren van deze tests is de behoefte aan gespecialiseerde, hoge kosten apparatuur. Hier, wordt een goedkope methode die tracks muis ambulation met behulp van gemakkelijk beschikbare middelen gepresenteerd.
De 6 minuten lopen afstand is een statistiek die vaak gebruikt als een instrument van de klinische beoordeling bij personen met Duchenne spierdystrofie5,6. Wijzigingen van deze maatregel hebben zijn gebruikt ter beoordeling van de resultaten in diermodellen voor Duchenne, met inbegrip van mdx muizen7 en golden retriever spierdystrofie (GRMD) honden8. In deze studie registreren wij vrijwillige open veld beweging in de 6 minuten direct na een milde oefening uitdaging. Ambulation afstand werd vervolgens berekend op basis van vrije open-source software voor het meten van horizontale beweging na verloop van tijd.
Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat de dieren kunnen worden getest in een scala aan instellingen zonder speciale apparatuur of hoge kosten commerciële software voor analyse. Een belangrijk aspect van deze analyse is dat het kan worden uitgevoerd in een omgeving van basic Labor zonder te verplaatsen of muizen uit de vivarium overbrengen in een gespecialiseerde core-faciliteit. Het protocol van de video-tracking hier beschreven kan is geschikt voor de beoordeling van de ambulation gedurende een relatief korte tijd-periode en detecteren activiteit verschillen tussen wild-type en mdx muizen, evenals onthullen functionele verbetering in een redding model van DMD.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het open veld assay biedt een effectieve en niet-invasieve manier om te testen motor functie in muismodellen van spier ziekte, en variaties van deze bepaling kunnen dienen als een waardevolle eindpunt maatregel voor pre-klinische studies. Een belangrijke beperking met dit type van test is de hoge kosten en beperkte toegankelijkheid van activiteit bewakingssystemen. In deze studie tonen we een systeem van de goedkope p.a. open veld activiteit die vergelijkbare resultaten aan bestaande commerciële software en apparatuur k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health [R01 AR048179 en R01 HL126204 R.C.W, T32 AR059033 en F32 AR069469to E.M.G] en de spierdystrofie vereniging VS [274143 en 416364 naar R.C.W.].
Materials
| Video camera | Apple Inc. | ME553LL/A | For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent) |
| Kinovea software (version 0.8.15) | Kinovea Association | Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org) | |
| iMovie (version 10.0.6) | Apple Inc. | Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional) | |
| Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber) | Rubbermaid | # 1778013 | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. |
| Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber) | US Acrylic, LLC | Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin. | |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | #000664 | Male 6 month mice |
| C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx) | Jackson Laboratory | #001801 | Male 6 month mice |
| mdx: utrophin-Tg (fiona) | Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies | Male 6 month mice |
Riferimenti
- Nagaraju, K., Carlson, G., De Luca, A. Behavioral and locomotor measurements using open field animal activity monitoring system. TREAT-NMD SOP Number M2.1.002. 2. 2, (2010).
- Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
- Kobayashi, Y. M., et al. Sarcolemma-localized nNOS is required to maintain activity after mild exercise. Nature. 456 (7221), 511-515 (2008).
- Belanto, J. J., et al. Microtubule binding distinguishes dystrophin from utrophin. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5723-5728 (2014).
- McDonald, C. M., et al. The 6-minute walk test in Duchenne/Becker muscular dystrophy: longitudinal observations. Muscle Nerve. 42 (6), 966-974 (2010).
- Mazzone, E., et al. Star Ambulatory Assessment, 6-minute walk test and timed items in ambulant boys with Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 20 (11), 712-716 (2010).
- Kobayashi, Y. M., Rader, E. P., Crawford, R. W., Campbell, K. P. Endpoint measures in the mdx mouse relevant for muscular dystrophy pre-clinical studies. Neuromuscul Disord. 22 (1), 34-42 (2012).
- Acosta, A. R., et al. Use of the six-minute walk test to characterize golden retriever muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 26 (12), 865-872 (2016).
- Sousa, N., Almeida, O. F., Wotjak, C. T. A hitchhiker’s guide to behavioral analysis in laboratory rodents. Genes Brain Behav. 5, 5-24 (2006).
- Gibbs, E. M., et al. High levels of sarcospan are well tolerated and act as a sarcolemmal stabilizer to address skeletal muscle and pulmonary dysfunction in DMD. Hum Mol Genet. 25 (24), 5395-5406 (2016).
- Gillis, J. M. Multivariate evaluation of the functional recovery obtained by the overexpression of utrophin in skeletal muscles of the mdx mouse. Neuromuscul Disord. 12, S90-S94 (2002).
- Tinsley, J., et al. Expression of full-length utrophin prevents muscular dystrophy in mdx mice. Nat Med. 4 (12), 1441-1444 (1998).
- Song, Y., et al. Suite of clinically relevant functional assays to address therapeutic efficacy and disease mechanism in the dystrophic mdx mouse. J Appl Physiol. 122 (3), 593-602 (2017).
- Bolivar, V. J. Intrasession and intersession habituation in mice: from inbred strain variability to linkage analysis. Neurobiol Learn Mem. 92 (2), 206-214 (2009).
