विच्छेदन और Drosophila Pupal अंडाशय के दाग
Summary
Drosophila अंडाशय स्टेम सेल आला विकास का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है । हालांकि लार्वा और वयस्क अंडाशय विदारक के लिए विधियां प्रकाशित किया गया है, pupal अंडाशय विच्छेदन विभिंन तकनीकों है कि विस्तार से प्रकाशित नहीं किया गया है की आवश्यकता है । यहां हम विच्छेदन, धुंधला, और बढ़ते pupal अंडाशय के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा ।
Abstract
वयस्क Drosophila अंडाशय के विपरीत, pupal अंडाशय का उपयोग करने के लिए अपेक्षाकृत मुश्किल है और उनके छोटे आकार, translucence के कारण की जांच, और एक pupal मामले के भीतर डिब्बे । pupal अंडाशय विदारक की चुनौती भी pupa के भीतर अपने भौतिक स्थान में निहित है: अंडाशय pupal पेट के अंदर वसा शरीर की कोशिकाओं से घिरे हुए हैं, और इन वसा कोशिकाओं को उचित एंटीबॉडी धुंधला के लिए अनुमति हटा दिया जाना चाहिए । इन चुनौतियों से उबरने के लिए, इस प्रोटोकॉल pupal पेट से वसा शरीर की कोशिकाओं को निकालने के लिए अनुकूलित पाश्चर pipets का इस्तेमाल करता है । इसके अलावा, एक चैम्बर्ड coverglass धुंधला प्रक्रिया के दौरान एक microcentrifuge ट्यूब के स्थान पर प्यूपा की दृश्यता में सुधार करने के लिए प्रयोग किया जाता है । हालांकि, इन और इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त उपकरणों के अंय लाभों के बावजूद, इन तकनीकों के सफल निष्पादन अभी भी pupal अंडाशय के छोटे आकार के कारण अभ्यास के कई दिनों में शामिल हो सकता है । इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित तकनीक समय पाठ्यक्रम प्रयोगों है जिसमें अंडाशय pupal विकास के विभिंन चरणों में विश्लेषण कर रहे है के लिए लागू किया जा सकता है ।
Introduction
स्टेम सेल Drosophila अंडाशय का उपयोग अनुसंधान व्यापक रूप से एक स्टेम सेल आला के पहले प्रलेखन के बाद से विस्तार किया गया है1,2,3,4। आनुवंशिक उपकरण पता लगाने वंश के विकास के बाद, Drosophila अंडाशय विच्छेदों सामांयतः स्टेम कोशिका वंश और संकेत रास्ते का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि स्टेम सेल के रखरखाव, प्रसार, और भाग्य स्टेम कोशिका आला में विनियमित । इन संकेतन रास्ते का ज्ञान ंयायपालिका स्टेम सेल गतिविधि5,6,7से उत्पंन कि कैंसर के संभावित कारणों में अंतर्दृष्टि उपज हो सकता है । यह भी हाल ही में दिखाया गया है कि Drosophila अंडाशय में दैहिक स्टेम कोशिकाओं, कूप स्टेम सेल (FSCs) के रूप में जाना, दृढ़ता से उनके संगठन के कई पहलुओं में स्तनधारी आंत्र स्टेम कोशिकाओं के समान8. इस कारण से, Drosophila अंडाशय स्टेम सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी मॉडल प्रणाली हैं ।
जबकि लार्वा और वयस्क अंडाशय आला में जल्दी स्टेम सेल विकास और अंतिम स्टेम सेल संगठन को सुराग प्रदान करते हैं, क्रमशः, pupal अंडाशय एक मध्यवर्ती संरचना है जिसमें germline और दैहिक कोशिकाओं को पुनर्गठित और उनकी पहचान की स्थापना 9 , 10. हालांकि कई अध्ययनों से pupal अंडाशय में ऊतक विकास के पहलुओं की जांच की है10,11,12,13, प्रश्न भेदभाव और स्थानिक संगठन के बारे में रहना pupal विकास के दौरान डिम्बग्रंथि कोशिका प्रकार के. विशेष रूप से, FSCs के विनिर्देशन इस अवधि के दौरान होता है । इस प्रोटोकॉल वांछित समय अंक पर विदारक और धुंधला pupal अंडाशय के लिए एक विधि रूपरेखा-एक तकनीक है कि समय पाठ्यक्रम प्रयोग में इस्तेमाल किया जा सकता है कि लार्वा से वयस्क मंच के विस्तार में pupal अंडाशय विकास का विश्लेषण ।
छोटे आकार, translucence, और pupal पेट के भीतर pupal अंडाशय के अप्राप्यता के लिए खाते में, इस प्रोटोकॉल एक कस्टम बनाया पतली-इत्तला दे दी पाश्चर प्लास्टिक के लिए पेट वसा शरीर ऊतक निरोधक एंटीबॉडी को दूर करने के लिए के रूप में उपकरण का उपयोग करता है अंडाशय. एक स्पष्ट, चैम्बर्ड coverglass एंटीबॉडी दाग के दौरान इस्तेमाल किया प्यूपा और एक “Nutator पर अंडाशय कमाल के लिए एक gentler मंच की अधिक से अधिक दृश्यता प्रदान करता है.” Maimon और Gilboa द्वारा लार्वा अंडाशय विच्छेदों के लिए एक प्रोटोकॉल के आधार पर14, ट्राइटन X-१०० की एक अपेक्षाकृत उच्च एकाग्रता के लिए सेल झिल्ली permeabilization और एंटीबॉडी पहुंच को अधिकतम करने के लिए धुंधला प्रक्रिया के प्रारंभिक चरणों में नियोजित किया गया है डिंबग्रंथि कोशिकाओं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल की सबसे महत्वपूर्ण और कठिन कदम निर्धारण करने से पहले pupal अंडाशय की तैयारी शामिल है । यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंडाशय, छोटे और pupal पेट के अंदर वसा शरीर कोशिकाओं द्वारा दफन, एंटीबॉडी के साथ पर…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (RO1 GM079351 to डी.) ने समर्थन दिया था. हम उसके मूल प्रोटोकॉल के आधार पर pupal अंडाशय विच्छेदन पर उसे उपयोगी सलाह के लिए Dorothea Godt धन्यवाद । हम भी उसकी सहायता और पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए एमी Reilein धंयवाद ।
Materials
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
Riferimenti
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetica. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).
