एक काइनेटिक प्रतिदीप्ति-Ca के आधार2 + जुड़ाव परख जी प्रोटीन की पहचान के लिए-युग्मित रिसेप्टर एगोनिस्ट, विरोधी, और Allosteric मॉडुलन
Summary
वर्णित सेलुलर परख CXC chemokine रिसेप्टर 4 की पहचान के लिए डिज़ाइन किया गया है (CXCR4)-एजेंटों कि बाधित या उत्तेजित, या तो प्रतिस्पर्धी या allosterically, intracellular Ca2 + रिलीज CXCR4 सक्रियण द्वारा शुरू बातचीत.
Abstract
जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) दवा उद्योग के लिए बहुत महत्व के हैं के रूप में वे कई मानव रोगों में शामिल हैं और अच्छी तरह से चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए मान्य लक्ष्य शामिल हैं. नेतृत्व यौगिकों की खोज, छोटे सिंथेटिक अणुओं सहित, कि विशेष रूप से रिसेप्टर के समारोह को बाधित, दवा के विकास में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम है और संवेदनशील, विशिष्ट, और मजबूत सेल आधारित परख पर निर्भर करता है. यहां, हम एक फ्लोरोसेंट readout के साथ एक काइनेटिक सेलुलर परख का वर्णन मुख्य रूप से रिसेप्टर की पहचान करने के लिए विशिष्ट विरोधी है कि intracellular Ca2 + रिलीज CXC chemokine रिसेप्टर 4 (CXCR4) के सक्रियकरण पर पैदा रोकना बनाया अंतर्जात ligand, द CXC chemokine ligand १२ (CXCL12). इस विधि का एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह भी आंतरिक agonistic गुणों के साथ संपंन यौगिकों की स्क्रीनिंग सक्षम बनाता है (यानी, यौगिकों में वृद्धि intracellular Ca2 + CXCL12 के अभाव में एकाग्रता) या यौगिकों allosteric बाइंडिंग साइटों (यानी, सकारात्मक और नकारात्मक allosteric मॉडुलन (पम्म और NAMs, क्रमशः)) के साथ बातचीत के माध्यम से रिसेप्टर्स समारोह संग्राहक. नीचे की ओर, फ्लोरोसेंट यौगिकों परख readout के साथ हस्तक्षेप हो सकता है, जिससे विश्वसनीय डेटा व्याख्या में बाधा । सबसे अधिक संभावना इस परख, ंयूनतम रूपांतरों के साथ कार्यांवित किया जा सकता है, जिनमें से कई अंय GPCRs के लिए एक सामांय दवा खोज परख के रूप में सक्रियकरण intracellular Ca के एक रिलीज की ओर जाता है2 +।
Introduction
GPCRs कोशिका सतह प्रोटीन की एक महत्वपूर्ण superfamily है जो extracellular ligand बाइंडिंग पर सिग्नल transduction कैस्केडिंग को सक्रिय करता है । वे पेप्टाइड्स, प्रोटीन हार्मोन, biogenic अमीन, और लिपिड सहित उत्तेजनाओं की एक बड़ी विविधता से सक्रिय किया जा सकता है, जो विविध intracellular संकेत मार्ग और अंत में जैविक प्रतिक्रियाओं की दीक्षा में परिणाम1,2 . इसके अलावा, GPCRs कई में शामिल हैं, नहीं तो सभी, विकासात्मक और शारीरिक प्रक्रियाओं और कई मानव रोगों बेकार GPCR संकेतन या रिसेप्टर एक्सप्रेस के साथ जुड़े रहे हैं. GPCRs चिकित्सा में सबसे मान्य औषधीय लक्ष्य1,3के बीच इसलिए कर रहे हैं ।
आमतौर पर, एक GPCR दवा खोज कार्यप्रवाह ऐसे छोटे अणुओं, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के रूप में यौगिकों की पहचान को सक्षम करने सेलुलर स्क्रीनिंग परख के साथ शुरू होता है, और पेप्टाइड्स कि एक विशेष GPCR की गतिविधि मिलाना कर सकते हैं. GPCR दवा खोज में कई परख के विभिंन प्रकार के लिए ऐसे यौगिकों, जिनमें से ज्यादातर मध्य के साथ संगत कर रहे है उच्च प्रवाह जांच अभियानों के लिए खोज मौजूद हैं । सबसे अधिक इस्तेमाल किया परख रिसेप्टर बाइंडिंग प्रयोगों, प्रतिदीप्ति या luminescence आधारित तथाकथित माध्यमिक दूतों (जैसे, Ca2 +, चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (AMP)), phenotypic के स्तर में उतार चढ़ाव का पता लगाने परख शामिल जांच परख, और β-arrestin भर्ती परख4। परख के एक विशेष प्रकार के लिए विकल्प कई कारकों पर निर्भर हो सकता है, लेकिन यह भी पहले एक दिया GPCR के संकेत गुणों के विषय में ज्ञान से निर्धारित है । एक GPCR के लिए बाध्यकारी एगोनिस्ट diphosphate जी प्रोटीन की guanidine-उपइकाई पर ट्राइफॉस्फेट GTP (α) के लिए guanidine heterotrimeric (जीडीपी) के आदान-प्रदान catalyzing एक गठनात्मक परिवर्तन लाती है । इसके बाद जीα-GTP उप इकाई से dissociates जीβγ उपइकाई और दोनों उपइकाईयों से आगे संकेतात्मक रास्ते आरंभ करेंगे. Hydrolysis के GTP-अणु और उसके बाद पुनः संघ के जीα-सकल घरेलू उत्पाद और जीβγ उपइकाईयों के जी प्रोटीन को अपने निष्क्रिय अनुरूप5,6में बहाल करेंगे । अनुक्रम के आधार पर gα उपइकाई के विभिन्न प्रकार के g प्रोटीन को परिभाषित किया जाता है (gs, gi, gq, g12/13)7. जीα उपइकाई के माध्यम से संकेतन इस तरह की वृद्धि के रूप में कई विशिष्ट प्रतिक्रियाओं को जन्म देता है (जीएसके माध्यम से) या कमी (जी के माध्यम सेi) चक्रीय AMP उत्पादन और intracellular सीए2 + संघटन (जीक्यू) के माध्यम से5 ,7. Gβγ उपइकाई भी intracellular प्रभाव मार्ग प्रेरित करने में सक्षम हैं । उदाहरण के लिए, जीमैं-युग्मित GPCRs के सक्रियकरण पर, जीβγ सीधे phospholipase सी (पीएलसी-β) inositol ट्राइफॉस्फेट उत्पादन करने के लिए उत्तेजित कर सकते हैं (आईपी3) कि intracellular स्टोर से सीए2 + की रिहाई ट्रिगर7 . निंनलिखित रिसेप्टर सक्रियकरण, GPCRs GPCR kinases (GRKs) जो β-arrestins के साथ बातचीत को बढ़ावा देता है द्वारा phosphorylated हैं । यह प्रक्रिया जी प्रोटीन संकेतन समाप्त हो जाती है और रिसेप्टर के लिए विसंवेदीकरण और अंततः internalization की ओर जाता है । β-arrestins भी बहु-आणविक परिसरों कि अन्य संकेतन जी प्रोटीन के स्वतंत्र रास्ते ट्रिगर कर सकते हैं बनाने के लिए सक्षम हैं8संकेतन ।
chemokine रिसेप्टर्स के उपपरिवार के भीतर, जीमैं-युग्मित CXCR4 एक GPCR है कि दवा की खोज के लिए एक होनहार लक्ष्य के रूप में ज्यादा ब्याज उठाया है । मानव इम्यूनो वायरस 1 के लिए एक प्रमुख सह रिसेप्टर के रूप में इसकी स्थापना की भूमिका को देखते हुए (एचआईवी-1) वायरल प्रवेश और संक्रमण, यौगिकों लक्ष्यीकरण CXCR4 शुरू में विरोधी एचआईवी दवा उंमीदवारों के रूप में विकसित किए गए थे9. हाल ही में, सबूत के एक बढ़ती शरीर tumorigenesis और कैंसर में CXCR4 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका की ओर इशारा किया है यह एक अच्छी तरह से कैंसर विज्ञान के रूप में अच्छी तरह से सत्यापित चिकित्सीय लक्ष्य10बनाने मेटास्टेसिस । CXCR4 अत्यधिक मानव कैंसर के बीस से अधिक प्रकार में व्यक्त की है और ट्यूमर सेल अस्तित्व, प्रसार, और प्रवास के साथ ही ट्यूमर से संबंधित angiogenesis10नियंत्रण । विभिंन रासायनिक वर्गों के CXCR4 विरोधी पहले11,12वर्णित किया गया है, लेकिन केवल छोटे अणु AMD3100 वर्तमान में एक स्टेम सेल समाज सेवा लिंफोमा के उपचार के दौरान इस्तेमाल एजेंट के रूप में क्लिनिक में उपयोग के लिए मंजूरी दे दी है और मायलोमा रोगियों13,14। नैदानिक परीक्षणों की सुरक्षा और विभिन्न मानव रोगों में कई अन्य CXCR4 विरोधी की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए चल रहे हैं, लेकिन ऑन्कोलॉजी12पर एक मजबूत ध्यान के साथ. CXCR4 विरोधी के लिए कई संभावित अनुप्रयोगों को देखते हुए, बेहतर pharmacokinetic गुणों के साथ उपंयास यौगिकों के लिए खोज, बेहतर जैव उपलब्धता, या संभावित कम दुष्प्रभाव वारंट है ।
इस के साथ साथ, एक काइनेटिक प्रतिदीप्ति आधारित सेलुलर परख मुख्य रूप से बाधा CXCR4 के लिए सक्षम यौगिकों के लिए स्क्रीन का वर्णन किया है । इस विधि के फ्लोरोसेंट माप intracellular Ca के क्षणिक वृद्धि पर आधारित है2 + एकाग्रता CXCR4 सक्रियण पर अपने अंतर्जात एगोनिस्ट द्वारा पैदा की, chemokine ligand CXCL12 (पूर्व stromal कोशिका व्युत्पंन फैक्टर 1α के रूप में जाना जाता है ( SDF1-α)), और इस CXCL12 के संभावित निषेध-प्रेरित Ca2 + विशेष यौगिकों द्वारा प्रतिक्रिया । इस परख में, U87 मानव ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं छुरा मानव CXCR4 रिसेप्टर व्यक्त किया जाता है । एक ही समय में, इन कोशिकाओं CXCR7 के अंतर्जात अभिव्यक्ति की कमी, एक संबंधित chemokine रिसेप्टर भी CXCL1215,16,17बांधता है । CXCR7 पहले भी CXCR4 के साथ heterodimers बनाने में सक्षम होना दिखाया गया है, जिससे इस बाद रिसेप्टर18के संकेतन गुण संग्राहक. intracellular ca के स्तर में उतार चढ़ाव2 + CXCR4 द्वारा मध्यस्थता fluo-2 acetoxymethyl (AM) एस्टर, एक सेल-पारगंय उच्च संबंध फ्लोरोसेंट सीए2 +-बाध्यकारी डाई के साथ CXCR4+ कोशिकाओं लदान द्वारा निगरानी कर रहे हैं । Fluo-2 हूं एक एकल तरंग दैर्ध्य फ्लोरोसेंट अणु कि ४९० एनएम पर उत्साहित किया जा सकता है, जबकि इसके उत्सर्जन प्रतिदीप्ति ५२० एनएम पर मापा जाता है । इस उत्सर्जन प्रतिदीप्ति ca पर बढ़ जाती है2 + बाइंडिंग, के बीच एक बड़ी गतिशील श्रेणी के साथ सीए2 +-बाउंड और असीमित स्थिति । फ्लोरोसेंट संकेत में वृद्धि क्षणिक है, कुछ ही मिनटों के एक समय अंतराल के भीतर होने वाली है, और बाद में क्षय होगा । फ्लोरोसेंट उत्सर्जन की चोटी ऊंचाई आगे रिसेप्टर सक्रियण के स्तर के साथ संबद्ध । परख ही एक प्रतिदीप्ति microplate एक तेज सीसीडी (आईसीसीडी) कैमरा है कि एक एकीकृत pipetting प्रणाली है कि परख में pipetting कदम के मानकीकरण की अनुमति देता है के पास के साथ सुसज्जित पाठक का उपयोग किया जाता है ( सामग्री की तालिकादेखें) . इसके अलावा, एक microplate के सभी कुओं में फ्लोरोसेंट संकेत के एक साथ माप प्रतिदीप्ति पाठक का एक और महत्वपूर्ण लाभ है कि प्रयोग किया जाता है । परख के पहले भाग के दौरान जांच के तहत यौगिकों (उदा, एक स्थिर एकाग्रता में या एक कमजोर पड़ने की श्रृंखला में छोटे अणुओं के एक पैनल) fluo-2 के लिए जोड़ रहे है CXCR4+ U87 कोशिकाओं के बाद एक ~ 10 मिनट की मशीन अवधि के दौरान जो यौगिकों के संभावित agonistic प्रभाव लगातार वास्तविक समय में मापा जाता है । फिर, अंतर्जात एगोनिस्ट (यानी, CXCL12) कोशिकाओं को जोड़ा जाता है एक CXCR4-मध्यस्थता क्षणिक वृद्धि intracellular Ca2 +के स्तर में पैदा करने के लिए । परख के इस भाग के दौरान परीक्षण यौगिकों के संभावित विरोधी गतिविधि का मूल्यांकन किया जा सकता है । परख के सामांय कार्यप्रवाह के एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्रा 1में प्रस्तुत किया है ।
हालांकि इस Ca2 + जुड़ाव परख मुख्य रूप से पहचान करने के लिए और प्रतिस्पर्धी CXCR4 विरोधी की निरोधात्मक शक्ति (यानी, यौगिकों कि बांध और रिसेप्टर को उत्तेजित करने के लिए अंतर्जात एगोनिस्ट को रोकने का निर्धारण किया गया है), यह भी रिसेप्टर एगोनिस्ट की पहचान कर सकते हैं और, इसके अलावा, यौगिकों कि allosteric साइटों पर बाध्यकारी द्वारा अपने समारोह में लागू (यानी, साइटों है कि स्थलाकृतिक अंतर्जात एगोनिस्ट द्वारा कब्जा orthosteric बंधन साइट से अलग). यौगिकों के उत्तरार्द्ध श्रेणी के उदाहरण allosteric एगोनिस्ट और पम्म और NAMs19,20शामिल हैं । जबकि रिसेप्टर-विशिष्ट विरोधी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से NAMs CXCL12 प्रेरित Ca2 + प्रतिक्रिया बाधित होगा, पम्म इस प्रतिक्रिया में वृद्धि होगी (भी चर्चा अनुभाग देखें). हालांकि परख वर्णित विशेष रूप से CXCR4 लक्ष्य, यह प्रत्याशित है कि इस विधि को ंयूनतम अनुकूलन प्रयास के साथ अंय GPCRs के लिए लागू किया जा सकता है, कम से कम अगर वे intracellular Ca के रिलीज के माध्यम से संकेत2 +।
Protocol
Representative Results
Discussion
Ca2 +-जुड़ाव परख वर्णित पहले से एक महत्वपूर्ण उपकरण की पहचान करने के लिए और रिसेप्टर विरोधी लक्ष्यीकरण CXCR417को निशाना बनने के लिए दिखाया गया है । यह है, तथापि, प्रत्याशित है कि इस विधि और आम तौर प?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए एरिक Fonteyn और गीर्ट Schoofs शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । इस काम को कू Leuven ने सपोर्ट किया है (ग्रांट नं. PF/10/018), शौकीनों voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, अनुदान सं. छ. 485.08), और सप्रेम Dormeur Vaduz.
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
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