Описанные сотовой assay предназначен для идентификации КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4)-взаимодействующих агентов, которые подавляют или стимулировать, либо конкурсной или allosterically, внутриклеточный Ca2 + релиз, инициированных CXCR4 активации.
G белок рецепторы (GPCR) имеют большое значение для фармацевтической промышленности, как они участвуют в многих болезней человека и включают в себя хорошо проверенных цели для терапевтической интервенции. Открытие соединений свинца, включая малые синтетические молекулы, которые специально препятствуют функции рецепторов, является важным первым шагом в разработке лекарств и опирается на чувствительных, конкретные и надежный анализов на основе ячеек. Здесь, мы описать кинетические сотовой пробирного с флуоресцентные индикация, предназначена главным образом для выявления рецептор специфических антагонистов, которые тормозят внутриклеточных Ca2 + релиз вызывали после активации КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4) путем его эндогенного лиганда, КЭС хемокиновых лигандом 12 (CXCL12). Основным преимуществом этого метода является, что он также позволяет скрининг соединений, наделенных агонистических свойств (например, соединения, вызывая увеличение внутриклеточной Ca2 + концентрации в отсутствие CXCL12) или соединений Модулирует функции рецепторов через взаимодействие с аллостерический привязки сайтов (то есть, положительные и отрицательные аллостерический модуляторы (ПАМС и NAMs, соответственно)). С другой стороны autofluorescent соединений может мешать пробирного индикация, препятствуя интерпретации надежных данных. Скорее этот assay может осуществляться, с минимальной адаптации, как открытие assay дженериков для многих других GPCR, из которых Активация приводит к выбросу внутриклеточных Ca2 +.
GPCR являются важным надсемейства клеток поверхности белков, которые активируют каскады трансдукции сигнала внеклеточных лигандов привязки. Они могут быть активированы широкий спектр стимулов, включая пептиды, белки гормоны, биогенные амины и липиды, что приводит к инициации различных внутриклеточных сигнальных путей и в конечном итоге биологических реакций1,2 . Кроме того GPCR участвуют во многих, если не все, развития и физиологических процессов и многих заболеваний человека связаны с неблагополучной GPCR сигнализации или рецептор гиперэкспрессия. GPCR, поэтому среди самых проверенных фармакологических целей в медицине1,3.
Как правило рабочий процесс обнаружения наркотиков ХВГФ начинается с сотовой скрининг анализов, способствующих выявлению соединений, таких как малые молекулы, моноклональных антител и пептиды, которые можно модулировать активность конкретного GPCR. В GPCR лекарств, что существует множество различных типов анализов для поиска таких соединений большинство из которых являются совместимыми с середины – для высокопроизводительного скрининга кампаний. Наиболее часто используемые анализы включают в себя эксперименты связывания рецептора, флуоресценции или свечения на основе обнаружения колебания уровня так называемых вторичных посыльных (например, Ca2 +, циклический аденозинмонофосфат (AMP)), фенотипические анализы отбор проб и β-arrestin набора assays4. Выбор для конкретного типа assay может зависеть от нескольких факторов, но также определяется предварительного знания, касающиеся сигнальных свойства данного GPCR. Агонист, привязка к ХВГФ вызывает конформационные изменения, катализирующих обмена дифосфат (ВВП) гуанидина для гуанидина трифосфата (GTP) на α-субъединица гетеротримерные G белков. Впоследствии Gα-GTP Субблок дистанцируется от субъединицаβγ G, и оба подразделения будут инициировать дальнейшие сигнальных путей. Гидролиз GTP-молекулы и последующего повторного ассоциации Gα– ВВП и Gβγ подразделений будет восстановить G-белка в ее неактивной конформации5,6. Основываясь на последовательность сходства субъединицы Gα определены различные типы G белков (Gs, G,i, Gq, G12/13)7. Сигнализации через Gα Субблок дает подняться несколько типичных ответы, такие как увеличение (через Gs) или уменьшить (через G,я) ЦАМФ производства и внутриклеточных Ca2 + мобилизации (через Gq)5 ,7. Gβγ субблоков могут также заставить внутриклеточные эффекторные пути. Например, после активации G,я-спаренных GPCR, Gβγ может непосредственно стимулировать фосфолипазы С (PLC-β) производить инозитол трифосфата (IP-3), который вызывает выпуск Ca2 + от внутриклеточного магазинов7 . После активации рецептора являются фосфорилированных GPCR, GPCR киназ (GRK), что способствует взаимодействию с β-arrestins. Этот процесс завершается G белка сигнализации и приводит к рецепторов десенсибилизации и в конечном итоге интернализации. Β-arrestins также возможность формирования различных молекулярных комплексов, которые могут вызвать другие сигнальные пути, независимо от сигнализации8G-белка.
В подсемейство хемокиновых рецепторов, Gя-спаренных CXCR4 является GPCR, вызвавший большой интерес как перспективные цели для обнаружения наркотиков. Учитывая ее созданы роль как основных ко-рецептор для вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-1) вирусный вход и инфекции, соединений, ориентация CXCR4 были первоначально разработаны как анти-ВИЧ наркотиков кандидатов9. Совсем недавно растущее количество доказательств указал на важную роль для CXCR4 опухолей и рака метастаз, что делает его хорошо проверенных терапевтических цели в онкологии, а также в10. CXCR4 высоко выражается в более чем двадцати видов человеческих раковых и выживание клетки опухоли контроля, распространение и миграции, а также ангиогенез опухоли, относящиеся10. Антагонисты CXCR4 различных химических классов ранее были описаны11,,12, но только малые молекулы, которые AMD3100 в настоящее время одобрен для использования в клинике как агент мобилизации стволовых клеток, используемый во время лечения лимфомы и больных миеломой13,14. Клинические испытания проводятся для оценки безопасности и эффективности нескольких других антагонистов CXCR4 в различных заболеваний человека, но с особым упором на онкологии12. Учитывая многие потенциальные приложения CXCR4 антагонистов, поиск новых соединений с улучшенные фармакокинетические свойства, повышение биодоступности или потенциально меньше побочных эффектов является оправданным.
Здесь, кинетическая на основе флуоресценции сотовой пробирного главным образом используется для экрана для соединений, способных ингибирующих CXCR4 описан. Флуоресцентный измерение этого метода основано на преходящее повышение концентрации внутриклеточного Ca2 + вызывали после активации CXCR4 к его эндогенного агонист, хемокиновых лигандом CXCL12 (ранее известный как стромальные клетки получены фактор 1α ( SDF1-α)) и потенциальные ингибирование этой CXCL12-индуцированной Ca2 + ответ конкретных соединений. В этот assay клетки человека глиобластома U87, стабильно выражая человека рецептор CXCR4 используются. В то же время эти клетки отсутствие эндогенного выражение CXCR7, связанной с хемокиновых рецепторов, которая также связывает CXCL1215,16,17. CXCR7 ранее также доказано быть способны формировать гетеродимерами с CXCR4, тем самым модуляции сигналов свойства этой последней рецептор18. Колебания уровня внутриклеточного Ca2 + опосредовано CXCR4 контролируются путем загрузки CXCR4+ клеток с эфира fluo-2 acetoxymethyl (AM), клетки проницаемой высоким сродством флуоресцентные Ca2 +-привязка красителя. FLUO-2 утра является одной длины волны флуоресцентные молекула, которая может быть возбужден в 490 Нм, в то время как его флуоресценции выбросов измеряется в 520 Нм. Этот флуоресценции выбросов увеличивает Ca2 + привязки, с большим динамическим диапазоном между Ca2 +-связанные и свободные государства. Увеличение флуоресцентного сигнала преходящими, происходящих в течение интервала времени несколько минут и потом будет распадаться. Пик высота Флуоресцентные выбросов еще коррелирует с уровнем активации рецептора. Сам генотипирования с помощью Считыватель микропланшетов флуоресценции, оснащена камерой активизировались CCD (ICCD), которая обладает интегрированной системы дозирования, которая позволяет стандартизация дозирования шаги в assay (см. Таблицу материалы) . Кроме того одновременное измерение флуоресцентного сигнала на всех скважинах Гонав является еще одним ключевым преимуществом флуоресценции Reader, которая используется. Во время первой частью соединений под следствием (например, группа малых молекул в фиксированной концентрации или в серии разрежения) добавляются к fluo-2 утра assay загружен CXCR4+ U87 клетки следуют ~ 10 мин инкубационный период во время которой потенциальные агонистических эффект соединений непрерывно измеряется в режиме реального времени. Затем, эндогенного агонистов (т.е., CXCL12) добавляется к клетки вызывают CXCR4-опосредованной преходящее повышение уровня внутриклеточного Ca2 +. В ходе этой части assay может оцениваться потенциальной антагонистической активности проверенных соединений. Схематический обзор общего процесса анализа представлена на рисунке 1.
Хотя этот Ca2 + мобилизации assay главным образом были использованы для выявления и определения ингибирующее потенции конкурентоспособных CXCR4 антагонистов (например, соединения, препятствующие эндогенного агониста для привязки и стимулировать рецептор), он также можно определить агонистами рецепторов и, Кроме того, соединения, прилагать свои функции путем связывания на аллостерический участках (например, сайты, которые топографически отличается от привязки сайта orthosteric, оккупирована эндогенного агонист). К последней категории соединений примеры аллостерический агонисты и пам и NAMs19,20. Тогда как антагонисты рецепторов конкретных, а также NAMs будет препятствовать CXCL12-индуцированной Ca2 + ответ, СМУУ усилит этот ответ (см. также обсуждение раздела). Хотя assay описаного конкретно цели CXCR4, предполагается, что этот метод может применяться для других GPCR с минимальным оптимизации усилий, по крайней мере если они сигнала через освобождение внутриклеточных Ca2 +.
Ca2 +-пробирного мобилизации, описанных ранее было показано, быть ценным инструментом для выявления и характеризуют антагонисты рецепторов, ориентация CXCR417. Однако, ожидается что этот метод может в целом применяться к большой группе других GPCR, которые вызывают цитозол?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Эрик Фонтейн и Geert Schoofs за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана ку Лёвен (Грант нет. PF/10/018), фондах воор Wetenschappelijk институте (FWO, Грант нет. G.485.08) и Фонд Dormeur Вадуц.
Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
Gelatin | Sigma | G9391 | |
AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |