קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric
Summary
וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.
Abstract
G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) הם חשיבות רבה תעשיית התרופות כפי שהם מעורבים למחלות רבות כוללות מטרות היטב המאומת התערבות טיפולית. גילוי של תרכובות עופרת, כולל מולקולות קטנות סינתטי, המעכבות באופן ספציפי את הפונקציה של הקולטן, שלב ראשוני חשוב בפיתוח תרופות, מסתמך על-מבוססות תא מבחני רגישות ספציפית, חזקים. כאן, אנו מתארים assay הסלולר קינטי עם readout פלורסנט בעיקר נועדה לזהות היריבים קולטן ספציפי המעכבות תאיים Ca2 + שחרור עורר על הפעלת הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4) על ידי שלה ליגנד אנדוגני, ליגנד כימוקין CXC 12 (CXCL12). יתרון מפתח של שיטה זו הוא כי זה גם מאפשר הקרנה של תרכובות ניחן מהותי במאפייני היתה ללא-חת (קרי, תרכובות העלאת עלייה תאיים Ca2 + ריכוז בהיעדרו של CXCL12) או תרכובות הכוח ויסות פונקציה הקולטן באמצעות אינטראקציה עם אתרי קישור allosteric (כלומר, מאפננים allosteric חיוביים ושליליים (PAMs ו NAMs, בהתאמה)). בצד למטה, autofluorescent תרכובות שעלולות להפריע העתק של וזמינותו, ובכך פוגעות פרשנות הנתונים אמין. קרוב לוודאי assay הזה ניתן ליישם, עם עיבודים מינימלית, כמו assay גילוי תרופה גנרית עבור רבים אחרים GPCRs מהם הפעלת מוביל לשחרור של Ca תאיים2 +.
Introduction
GPCRs הם superfamily חשוב של חלבונים פני שטח התא להפעיל האות התמרה חושית אשדים על איגוד ליגנד חוץ-תאית. הם יכולים להיות מופעל על ידי מגוון רחב של גירויים כולל פפטידים, הורמונים חלבון, אמינים biogenic של שומנים, דבר המתבטא אתחול של מגוון תאיים איתות המסלולים ותגובות ביולוגיות בסופו של דבר1,2 . יתר על כן, GPCRs מעורבים רבים, אם לא כולם, תהליכים פיזיולוגיים התפתחותיים, למחלות רבות קשורים עם ביטוי איתות או קולטן GPCR לקוי. GPCRs ולכן הם בין המטרות תרופתי המאומת ביותר ברפואה1,3.
עם הסלולר מבחני המיון הפעלת הזיהוי של תרכובות כגון מולקולות קטנות, נוגדנים חד-שבטיים פפטידים יכול לווסת את הפעילות של GPCR מסוים מתחיל בדרך כלל, זרימת עבודה גילוי סמים GPCR. קיימים סוגים רבים ושונים של מבחני כדי לחפש תרכובות כגון גילוי סמים GPCR, אשר רובם תואמים קמפיינים ההקרנה באמצע – כדי תפוקה גבוהה. מבחני הנפוצה ביותר נמנים קולטן איגוד ניסויים, זריחה או הפריה חוץ גופית בסיס מבחני איתור תנודות ברמת כביכול משני שליחים (למשל, Ca2 +, אדנוזין מחזורית monophosphate (כח)), פנוטיפי מבחני המיון והגיוס β-arrestin מבחני4. הבחירה עבור סוג מסוים של assay תלויים גורמים רבים, אך גם נקבעת על-ידי ידע מוקדם לגבי מאפייני GPCR נתון איתות. אגוניסט איגוד GPCR גורם לשינוי הסתגלותי ותזרז את חילופי guanidine diphosphate (תמ ג) עבור guanidine טריפוספט (GTP) בα-יחידת משנה של חלבונים heterotrimeric G. לאחר מכן יחידת -GTP משנהαG dissociates של יחידת משנהβγ G, שני subunits תיזום עוד איתות המסלולים. הידרוליזה של מולקולת GTP ושיוך מחדש העוקבים של Gα– תוצר ו- Gβγ subunits יגרום לשחזור החלבון G לתוך שלו לא פעיל קונפורמציה5,6. מבוסס על רצף הדמיון של יחידת משנהα G מוגדרות סוגים שונים של חלבונים ג’י (GsGאני, ג’יקיו, G12/13)7. איתות באמצעות Gα יחידה משנית נותן לעלות מספר תגובות טיפוסיות כגון העלייה (via Gs) או להקטין (via Gאני) של ייצור מחזורי AMP Ca2 + גיוס תאיים (via Gq)5 ,7. Gβγ subunits מסוגלים גם לזירוז אפקטור תאיים מסלולים. למשל, בעת ההפעלה של Gאני-בשילוב GPCRs, Gβγ ישירות יכול לעורר phospholipase C (PLC-β) כדי לייצר אינוזיטול טריפוספט (IP3) שמפעיל את שחרורו של Ca2 + מחנויות תאיים7 . בעקבות הפעלת קולטן, GPCRs הן phosphorylated על ידי kinases GPCR (GRKs) אשר מקדם את האינטראקציה עם β-arrestins. תהליך זה מסתיימת איתות חלבון G ומוביל אל קולטן הקהיה ובסופו של דבר הפנמה. Β-arrestins הם גם מסוגלים להקים מתחמי מולקולרית רב שניתן להשתמש בהם להנעת איתות המסלולים אחרות עצמאית של חלבון G איתות8.
בתוך תת משפחה של קולטני כימוקין, Gאני-CXCR4 בשילוב זה GPCR זה העלה את עניין רב כמטרה מבטיח לגילוי סמים. בהתחשב בתפקיד הוקמה קולטן שותף מרכזי עבור וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1) 1 הפוסט ויראלי, זיהום, תרכובות מיקוד CXCR4 פותחו בתחילה כמו האיידס סמים מועמדים9. לאחרונה, גוף גדל והולך של ראיות יש הצביע על תפקיד חשוב עבור CXCR4 ב tumorigenesis, סרטן גרורות הפיכתה למטרה טיפולית היטב המאומת באונקולוגיה גם10. CXCR4 מתבטא גבוהה יותר מעשרים סוגי סרטן אנושי, פקדים גידול התא הישרדות, התפשטות, ואת ההעברה, כמו גם אנגיוגנזה הקשורות הגידול10. CXCR4 היריבים של מחלקות כימיים שונים בעבר היה מתואר11,12, אלא רק מולקולה קטנה ש-amd3100 כרגע מאושר לשימוש במרפאה כסוכן גיוס תאי הגזע משמש במהלך הטיפול של לימפומה 13,של חולי מיאלומה14. ניסויים קליניים מתנהלות כדי להעריך את הבטיחות והיעילות של מספר היריבים האחרים של CXCR4 מחלות אנושיות שונות, אך עם דגש חזק על אונקולוגיה12. בהתחשב של יישומים פוטנציאליים רבים עבור CXCR4 היריבים, נדרש לחפש תרכובות הרומן עם המאפיינים פרמוקוקינטיים משופרת, שיפור הזמינות הביולוגית או שעשויות להיות פחות תופעות לוואי.
במסמך זה, קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית הסלולר assay המשמשת בעיקר כדי מסך עבור תרכובות מסוגל עיכוב CXCR4 מתואר. המדד פלורסנט של שיטה זו מבוססת על גידול ארעי תאיים Ca2 + הריכוז עורר על CXCR4 ההפעלה על-ידי אגוניסט אנדוגני שלה, ליגנד כימוקין CXCL12 (המוכרת בשם תאי סטרומה נגזר (1α פקטור SDF1-α)), ועיכוב פוטנציאלי של CXCL12-induced Ca2 + תגובה זו על ידי תרכובות מסוים. זה assay, משמשים תאים גליובלסטומה האנושי U87 stably להביע את הקולטן CXCR4 אנושי. במקביל, תאים אלה חוסר בביטוי אנדוגני של CXCR7, קולטן כימוקין קשורים המאגד גם CXCL1215,16,17. CXCR7 בעבר גם הוכח להיות מסוגל להרכיב heterodimers עם CXCR4, ובכך להתכוונן המאפיינים איתות של זה האחרון קולטן18. תנודות ברמת תאיים Ca2 + מתווכת על-ידי CXCR4 המפוקחים על-ידי טעינת CXCR4 את+ תאים עם אסתר fluo-2 acetoxymethyl (AM), זיקה גבוהה תא חדיר פלורסנט Ca2 +-איגוד לצבוע. Fluo-2 בבוקר הוא מולקולה פלורסנט אורך גל יחיד יכול להתרגש 490 nm בזמן זריחה הפליטה שלו נמדד ב- 520 ננומטר. זריחה פליטה זו עולה על Ca2 + איגוד, עם טווח דינמי גדול בין Ca2 +-מאוגדים, לא מאוגדים המדינה. העלייה ברמת אות ניאון ארעית, המתרחשים בתוך מרווח זמן של כמה דקות, תרקב לאחר מכן. שיא גובה ה”מפה נוספת פליטה פלורסנט עם הרמה של הפעלת קולטן. הבדיקה עצמה מתבצעת באמצעות קורא microplate קרינה פלואורסצנטית מצויד עם מצלמת CCD התעצמה (ICCD) שמחזיק מערכת pipetting משולבת המאפשרת סטנדרטיזציה של המדרגות pipetting ב וזמינותו (ראה טבלה של חומרים) . בנוסף, המדידה בו זמנית של האות פלורסנט בבארות כל של microplate הוא יתרון נוסף מפתח של הקורא פלורסצנטיות המשמש. במהלך הראשון חלק וזמינותו תרכובות תחת חקירה (למשל, פאנל של מולקולות קטנות על ריכוז קבוע או בסדרה דילול) מתווספים אני fluo-2 נטען CXCR4+ U87 תאים ואחריו ~ תקופת דגירה 10 דקות במהלכו ההשפעה היתה ללא-חת הפוטנציאלי של תרכובות נמדד באופן רציף בזמן אמת. לאחר מכן, אגוניסט אנדוגני (קרי, CXCL12) מתווסף לתאים כדי לעורר את גידול ארעי בתיווך CXCR4 של רמת Ca תאיים2 +. במהלך חלק זה של וזמינותו ניתן להעריך את הפעילות אויבת פוטנציאלית של תרכובות שנבדקו. סקירה סכמטי של זרימת העבודה הכללית של וזמינותו מוצג באיור1.
למרות זו Ca2 + גיוס assay שימש בעיקר לזהות ולקבוע את הפוטנציה המעכבת של אנטגוניסטים תחרותיים CXCR4 (קרי, תרכובות למנוע אגוניסט אנדוגני לאגד ולעורר את הקולטן), זה גם ניתן לזהות אגוניסטים לקולטן, בנוסף, תרכובות זה להפעיל את הפונקציה על-ידי איגוד באתרים allosteric (קרי, אתרים שונים טופוגרפית מאתר איגוד orthosteric שנכבשו על ידי אגוניסט אנדוגני). דוגמאות לאפשרות השנייה של תרכובות אגוניסטים allosteric ו-19,PAMs ו NAMs20. ואילו היריבים קולטן ספציפי, כמו גם NAMs לעכב את התגובה CXCL12-induced Ca2 + , PAMs מקדמים תגובה זו (ראה גם הדיון בסעיף). למרות וזמינותו המתוארים בזאת במפורש מטרות CXCR4, הוא צפוי כי בשיטה זו ניתן להחיל על אחרים GPCRs מאמץ מינימלי אופטימיזציה, לפחות אם הם משדרים דרך שחרורו של Ca תאיים2 +.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ca2 +-גיוס assay המתוארים בזאת שהוצג בעבר להיות כלי חשוב כדי לזהות ולאפיין את היריבים קולטן מיקוד CXCR417. הוא, עם זאת, צפוי כי בשיטה זו ניתן באופן כללי יותר להחיל על קבוצה גדולה של אחרים GPCRs המפעילות Ca2 + שחרור cytosolic בעת ההפעלה שלהם, כמופיע עבור כימוקין קשורים הקולטן CCR5. ואילו…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות אריק Fonteyn, מירב ניצן שופס לסיוע טכני מעולה. עבודה זו בתמיכתם של לופן KU (מענק. לא. PF/10/018), voor Fonds Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, להעניק. לא. G.485.08), וואדוז Dormeur את Fondation.
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
Riferimenti
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D’Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. . Chemokine Biology – Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).
