Un'analisi cinetica basata sulla fluorescenza Ca2 + mobilizzazione per identificare il G proteina-ha accoppiato il ricevitore agonisti, antagonisti e modulatori allosterici
Summary
Il saggio cellulare descritto è stato progettato per l’identificazione del recettore per chemochine CXC 4 (CXCR4)-agenti interagenti che inibiscono o stimolano, sia competitivo o allosterico, il Ca2 + rilascio intracellulare avviato dall’attivazione di CXCR4.
Abstract
I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) sono di grande importanza per l’industria farmaceutica come sono implicati in molte malattie umane e includere obiettivi ben convalidati per intervento terapeutico. Scoperta di composti di piombo, tra cui piccole molecole sintetiche, che specificamente inibiscono la funzione del ricevitore, è un passo iniziale importante nello sviluppo di farmaci e si basa su analisi cell-based sensibili, specifiche e robuste. Qui, descriviamo un’analisi cinetica cellulare con una lettura fluorescente progettata principalmente per identificare gli antagonisti di recettori specifici che inibiscono il Ca2 + rilascio intracellulare evocato al momento dell’attivazione del recettore di chemochine CXC 4 (CXCR4) dal suo ligando endogeno, il ligando di chemochine CXC 12 (CXCL12). Un vantaggio chiave di questo metodo è che permette anche lo screening di composti dotati di proprietà intrinseche agonistica (cioè, composti che provoca un aumento della concentrazione intracellulare di Ca2 + in assenza di CXCL12) o composti modulazione della funzione del recettore attraverso l’interazione con i siti di legame allosterico (cioè, modulatori allosterici positivi e negativi (PAMs e NAMs, rispettivamente)). Sul lato negativo, autofluorescent composti potrebbero interferire con indicazione del dosaggio, ostacolando quindi interpretazione dei dati affidabile. Molto probabilmente questo dosaggio può essere implementato, con adattamenti minimi, come un saggio di scoperta di farmaci generici per molti altri GPCR di cui l’attivazione conduce ad un rilascio di Ca intracellulare2 +.
Introduction
GPCR sono un’importante superfamiglia di proteine di superficie delle cellule che attivano cascate di trasduzione del segnale al ligando extracellulare. Possono essere attivati da una grande varietà di stimoli compreso peptidi, ormoni proteici, ammine biogene e lipidi, che provoca l’avvio di diverse vie di segnalazione intracellulare e risposte biologiche alla fine1,2 . Inoltre, GPCR sono coinvolti in molti, se non tutti, i processi fisiologici e di sviluppo e molte malattie umane sono associati con sovraespressione di segnalazione o recettori GPCR disfunzionale. GPCR rientrano pertanto tra i bersagli farmacologici più convalidati in medicina1,3.
In genere, un flusso di lavoro GPCR droga scoperta inizia con saggi di screening cellulare che consentano l’identificazione di composti quali piccole molecole, anticorpi monoclonali e peptidi che possono modulare l’attività di un GPCR particolare. Nella scoperta della droga GPCR esistono molti diversi tipi di analisi per la ricerca di tali composti, molti dei quali sono compatibili con le campagne di screening resa medio-alta. I saggi più utilizzati comprendono esperimenti di binding recettoriale, fluorescenza o luminescenza basato saggi rilevare le fluttuazioni nel livello del cosiddetti messaggeri secondari (per esempio, Ca2 +, monofosfato di adenosina ciclico (AMP)), fenotipiche analisi della selezione e reclutamento di β-arrestina dosaggi4. La scelta per un particolare tipo di analisi può dipendere da diversi fattori, ma è anche determinata dalla conoscenza preventiva riguardante le proprietà di segnalazione di un GPCR determinato. Agonista vincolante di un GPCR induce un cambio conformazionale che catalizza lo scambio di difosfato di guanidina (PIL) per trifosfato di guanidina (GTP) sulla α-subunità delle proteine G eterotrimeriche. Successivamente la subunità di Gα-GTP si dissocia dalla subunitàβγ G ed entrambe le subunità avvierà ulteriori vie di segnalazione. Idrolisi della molecola di GTP e successiva ri-associazione il Gα– PIL e subunitàβγ G ripristinerà la proteina di G nella sua conformazione inattiva5,6. Basato su somiglianza di sequenza della subunitàα G sono definiti diversi tipi di proteine G (Gs, Gi, G,q, G12/13)7. Segnalazione tramite il Gα subunità dà luogo a diverse risposte tipiche come l’aumento (via Gs) o diminuire (via Gio) di produzione di AMP ciclico e mobilizzazione intracellulare di Ca2 + (via Gq)5 ,7. Subunitàβγ G sono anche in grado di indurre vie effettrici intracellulari. Per esempio, al momento dell’attivazione di Gio-GPCR accoppiati, Gβγ può stimolare direttamente la fosfolipasi C (PLC-β) per la produzione di inositolo trifosfato (IP3) che innesca il rilascio di Ca2 + dai depositi intracellulari7 . Dopo l’attivazione dei recettori GPCR sono fosforilati da chinasi GPCR (GRK) che favorisce l’interazione con β-arrestins. Questo processo termina G proteina di segnalazione e conduce alla interiorizzazione e alla fine la desensibilizzazione del recettore. Β-arrestins sono anche in grado di formare complessi multi-molecolari che possono innescare altre vie di segnalazione indipendente di segnalazione8G di proteine.
All’interno della sottofamiglia dei recettori per le chemochine, Gio-CXCR4 accoppiato è un GPCR che ha suscitato molto interesse come un bersaglio promettente per la scoperta di nuovi farmaci. Dato il suo ruolo stabilito come un importante co-recettore per il virus di immunodeficenza umana 1 (HIV-1) entrata virale e infezione, composti CXCR4 di targeting sono stati inizialmente sviluppati come farmaco anti-HIV candidati9. Più recentemente, un corpo crescente di prova ha indicato un ruolo importante per CXCR4 nella tumorigenesi e cancro metastasi che lo rende un obiettivo terapeutico e validato in oncologia pure10. CXCR4 è altamente espresso in più di venti tipi di cancro umano e controlla la sopravvivenza delle cellule del tumore, proliferazione e migrazione, nonché l’angiogenesi tumore-relativi10. CXCR4 antagonisti di classi chimiche differenti precedentemente sono stati descritti11,12, ma solo la piccola molecola che AMD3100 è attualmente approvato per l’uso in clinica come un agente di mobilizzazione delle cellule staminali usato durante il trattamento di linfoma e mieloma pazienti13,14. Studi clinici sono in corso per valutare la sicurezza e l’efficacia di parecchi altri antagonisti di CXCR4 in diverse malattie umane, ma con un forte focus su oncologia12. Data le molte applicazioni potenziali per CXCR4 antagonisti, è opportuna la ricerca di nuovi composti con proprietà farmacocinetiche migliorata, migliorata biodisponibilità o potenzialmente meno effetti collaterali.
Qui, un’analisi di cellulare cinetica fluorescenza-basata principalmente usato per schermo per composti capaci di inibire CXCR4 è descritto. Le misure in fluorescenza di questo metodo si basa sull’aumento transitorio della concentrazione intracellulare di Ca2 + evocata all’attivazione di CXCR4 dal suo agonista endogeno, il ligando di chemochina CXCL12 (precedentemente noto come fattore 1 α (derivati da cellule stromali SDF1-α)) e la potenziale inibizione di questa risposta2 + Ca CXCL12-indotta da particolari composti. In questa analisi, le cellule di glioblastoma umano U87 che esprimono il recettore CXCR4 umano sono utilizzate. Allo stesso tempo, queste cellule mancano dell’espressione endogena di CXCR7, un ricevitore di chemokine correlate che si lega anche CXCL1215,16,17. CXCR7 ha tradotto anche dimostrato di essere in grado di formare eterodimeri con CXCR4, quindi modulazione delle proprietà segnalazione di questo recettore quest’ultimo18. Fluttuazioni del livello di Ca intracellulare2 + mediata da CXCR4 sono monitorate caricando il CXCR4+ cellule con estere acetossimetil fluo-2 (AM), una cellula-permeabile ad alta affinità fluorescente Ca2 +-associazione tintura. Fluo-2 AM è una molecola fluorescente di singola lunghezza d’onda che possa essere eccitata a 490 nm, mentre la sua fluorescenza emissione viene misurata a 520 nm. Questa fluorescenza emissione aumenta legandosi Ca2 + , con un ampio range dinamico tra il Ca2 +-associati e non associati di stato. L’aumento del segnale fluorescente è transitoria, che si verificano entro un intervallo di tempo di pochi minuti e decadrà in seguito. L’altezza di picco dei correlati ulteriori emissione fluorescente con il livello di attivazione del recettore. Il dosaggio stesso viene eseguito utilizzando un lettore di micropiastre fluorescenza dotato di una fotocamera CCD intensificato (ICCD) che possiede un sistema di pipettaggio integrato che permette la standardizzazione delle operazioni pipettaggio nell’analisi (Vedi Tabella materiali) . Inoltre, la misura simultanea del segnale fluorescente in tutti i pozzetti di una micropiastra è un altro vantaggio chiave del lettore di fluorescenza che viene utilizzato. Durante la prima parte del saggio i composti in esame (ad esempio, un pannello di piccole molecole ad una concentrazione fissa o in una serie di diluizioni) vengono aggiunti al fluo-2am caricato CXCR4+ U87 cellule seguirono da un ~ periodo di incubazione di 10 min durante il quale l’effetto potenziale agonistico dei composti è misurato continuamente in tempo reale. Quindi, l’agonista endogeno (cioè, CXCL12) viene aggiunto alle cellule per evocare un aumento transitorio CXCR4-mediata del livello di intracellulare di Ca2 +. Durante questa parte del test può essere valutato il potenziale attività antagonista dei composti testati. Una panoramica schematica del flusso di lavoro generale del dosaggio è presentata nella Figura 1.
Anche se questo test di mobilizzazione di Ca2 + è stato utilizzato principalmente per identificare e determinare la potenza inibitoria di antagonisti competitivi di CXCR4 (cioè, composti che impediscono l’agonista endogeno per legare e stimolare il recettore), esso anche agonisti del recettore in grado di identificare e, inoltre, i composti che esercitano la loro funzione legandosi a siti allosterici (cioè, siti che topograficamente differiscono dal sito di legame ortosterici occupato da agonista endogeno). Sono esempi di quest’ultima categoria di composti agonisti allosterici e PAMs e NAMs19,20. Considerando che gli antagonisti del recettore specifico, nonché NAMs sarebbe inibiscono la CXCL12-indotta di Ca2 + risposta, PAMs migliorerebbe questa risposta (veda inoltre la discussione sezione). Anche se il dosaggio descritto nel presente documento in particolare obiettivi CXCR4, si prevede che questo metodo può essere applicato a altri GPCR con sforzo minimo ottimizzazione, almeno se segnalano tramite il rilascio di Ca intracellulare2 +.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il Ca2 +-saggio di mobilitazione qui descritto precedentemente è stato indicato per essere un valido strumento per identificare e caratterizzare antagonisti del recettore CXCR417di targeting. Si prevede, tuttavia, che questo metodo può essere applicato più generalmente a un folto gruppo di altri GPCR che innescano un Ca2 + rilascio citosolico al momento della loro attivazione, come illustrato per il ricevitore di chemokine correlate CCR5. Considerando che nel caso di CCR5 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Eric Fonteyn e Geert Schoofs per l’eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da KU Leuven (grant no. PF/10/018), il Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, concedere no. G.485.08) e la Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
Riferimenti
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D’Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. . Chemokine Biology – Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).
