운동 형광 기반 Ca2 + 동원 분석 결과 G 단백질 결합 된 수용 체 주 작동 근, 길 항 근, 그리고 Allosteric 변조기를 식별 하

Summary

설명된 세포 분석 결과 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 식별을 위해 설계 되었습니다-상호 작용 하거나 에이전트는 억제 자극, 경쟁적으로 또는 allosterically, 세포내 캘리포니아^{2 +} 릴리스 CXCR4 활성화에 의해 시작.

Abstract

그들은 많은 인간 질병에 관여 하 고 치료 적 개입에 대 한 잘 검증된 대상 포함 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs) 제약 산업에 매우 중요 있습니다. 특히 수용 체의 기능을 억제, 작은 합성 분자를 포함 한 리드 화합물의 발견 약물 개발에 중요 한 초기 단계 이며, 특정, 민감하고 강력한 세포 기반 분석에 의존. 여기, 우리 설명 운동 세포 분석 결과 세포내 캘리포니아^{2 +} 릴리스 갖는 CXC chemokine 수용 체 4 (CXCR4)의 활성화를 억제 하는 특정 수용 체 길 항 제를 식별 하는 데 주로 사용 하는 형광 판독 하 여 그 내 인 성 ligand, CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) 이 방법의 주요 장점은 있다는 것 이다 또한 부여 기본 agonistic 속성 (즉, 세포내 캘리포니아^{2 +} 농도 부재에서 CXCL12의 증가 도출 하는 화합물) 또는 화합물 화합물의 심사 allosteric 바인딩 사이트와의 상호 작용을 통해 수용 체의 기능 변조 (즉, 포지티브 및 네거티브 allosteric 변조기 (PAMs 및 NAMs, 각각)). 아래쪽 측면에서 autofluorescent 화합물은 분석 결과 판독, 신뢰할 수 있는 데이터 해석 함으로써 방해를 방해할 수 있습니다. 대부분이 분석 결과 구현할 수 있습니다, 최소한의 적응으로 많은 다른 GPCRs의 활성화 리드 세포내 캘리포니아^{2 +}의 출시에 대 한 일반적인 약물 발견 분석 결과로.

Introduction

GPCRs는 extracellular ligand 바인딩 시 신호 변환 폭포를 활성화 하는 세포 표면 단백질의 중요 한 superfamily. 그들은 다양 한 세포내 신호 통로 결국 생물학 응답^{1,2의 개시 귀착되는 자극 펩 티 드, 단백질 호르몬, 생물 아민, 지질 등의 큰 다양성에 의해 활성화 될 수 있다} . 또한, GPCRs 관련 된 많은 경우 모든, 발달 및 생리 적 프로세스와 많은 인간 질병 장애 GPCR 신호 또는 수용 체 overexpression와 연결. GPCRs는 그러므로 약^1,3에서 가장 검증 된 약리 목표 사이.

일반적으로, GPCR 약물 발견 워크플로 셀룰러 심사 분석 활성화 작은 분자, 단일 클론 항 체, 등 특정 GPCR의 활동을 조절 수 있는 펩 티 드 화합물의 식별으로 시작 합니다. GPCR 신약 같은 화합물에 대 한 검색을 존재 하는 다양 한 유형의 분석 실험에 대부분의 중반-를 높은 처리량 검열 캠페인와 호환 됩니다. 가장 많이 사용 되는 분석 실험 포함 수용 체 바인딩 실험, 형광 또는 발광 기반 분석 실험의 소위 2 차 메신저 (예를 들어, 캘리포니아^{2 +}, 순환 아데노신 monophosphate (AMP)), phenotypic 수준에서 변동 감지 심사 분석, 및 β-arrestin 모집⁴분석 실험. 분석 결과의 특정 유형에 대 한 선택, 여러 요인에 따라 달라질 수 있습니다 하지만 또한 사전 지식에 관한 특정된 GPCR의 신호 속성에 의해 결정 됩니다. 길 항 제는 GPCR에 바인딩 heterotrimeric G 단백질의 α 소 단위에 guanidine 3 인산 염 (GTP)에 대 한 guanidine diphosphate (GDP)의 교환 catalyzing 구조적 변화를 유도 합니다. 그 후 G_α-GTP 소 단위 G_βγ 소 단위에서 dissociates 고 두 소 단위 신호 통로 더 시작 됩니다. 가수분해 GTP 분자와 G_α의 후속 다시 협회의 GDP와 G_βγ 소 단위 복구할 것 이다 G 단백질 그것의 비활성 형태^5,6. 따라 시퀀스 유사성 G_α 소 단위의 G 단백질의 종류 정의 (G_sG_나, G_q, G_12/13)⁷. G_α 를 통해 신호 소 단위 (G_s)를 통해 상승 증가 등 여러 가지 일반적인 답변을 또는 준다 순환 앰프 생산 및 세포내 캘리포니아^{2 +} (G_q)를 통해 동원 (G_나)를 통해 감소^{5 ,7}. G_βγ 소 단위 세포내 이펙터 경로 유도 할 수 있습니다. 예를 들어, G_나의 활성화 시-결합 된 GPCRs, G_βγ 직접 phospholipase C (PLC-β) 이노 시 톨 3 인산 염 (IP₃)를 생산 하는 세포내 상점^{7 캘리포니아2 + 의 릴리스 자극 수} . 수용 체 활성화, 다음 GPCRs GPCR kinases (GRKs) β-arrestins와의 상호 작용을 촉진 하 여 phosphorylated는. 이 프로세스는 G 단백질 신호 종료 하 고 수용 체 탈 감 작 및 결국 국제화. Β-arrestins 다른 신호 통로⁸를 신호 하는 G 단백질의 독립 실행할 수 있는 다중 분자 복합물을 형성 수 있습니다.

G_나chemokine 수용 체 subfamily 내-결합된 CXCR4는 GPCR 약물 발견에 대 한 유망 대상으로 많은 관심을 제기 하고있다. 인간 면역 결핍 바이러스 1 (hiv-1)에 대 한 주요 공동 수용 체로 서의 설립된 역할 주어진 바이러스 항목 및 감염, 화합물 CXCR4를 대상으로 처음으로 개발 되었다 항 HIV 약물 후보⁹. 더 최근에, 증거의 성장 시체는 지적 했다 중요 한 역할을 CXCR4 위한 tumorigenesis 및 암 전이 뿐만 아니라 종양에 잘 검증 된 치료 대상 만들기에¹⁰. 20 개 이상 유형의 인간 암 및 컨트롤 종양 세포 생존, 확산, 그리고 마이그레이션 뿐만 아니라 종양 관련 신생¹⁰CXCR4 매우 표현 된다. 다른 화학 수업의 CXCR4 antagonists 설명된^11,12, AMD3100 현재 림프 종의 치료 하는 동안 사용 되는 줄기 세포 동원 요원으로 병원에서 사용 하기 위해 승인 작은 분자에만 하지만 이전 되었습니다. 그리고 골 수 종 환자^13,14. 임상 시험 진행 안전 및 여러 다른 CXCR4 길 항 근의 종양학¹²에 강한 초점 하지만 다른 인간 질병에 효능을 평가 하는. 주어진 CXCR4 길 항 제에 대 한 많은 잠재적인 응용 프로그램, 향상 된 pharmacokinetic 속성, 향상 된 생체 이용률, 또는 잠재적으로 적은 부작용 소설 화합물에 대 한 검색 보증 된다.

여기, 키네틱 형광 기반 셀룰러 분석 결과 주로 하는 데 사용 화합물 CXCR4 억제의 능력에 대 한 화면 설명. 이 방법의 형광 측정의 내 생 적인 주 작동 근, chemokine ligand (이전으로 알려진 stromal 세포 파생 요소 1α (CXCL12에 의해 CXCR4 활성화 시 갖는 세포내 캘리포니아^{2 +} 농도의 일시적 증가에 따라 SDF1-α)), 그리고이 CXCL12 유도 캘리포니아^{2 +} 응답 특정 화합물의 잠재적 저해. 이 분석 결과에서는 U87 인간의 세포종 세포 인간의 CXCR4 수용 체를 표현 안정적으로 사용 됩니다. 동시에 이러한 셀 CXCR7, 관련된 chemokine 수용 체는 또한 CXCL12^15,,1617의 내 생 적인 표현 부족. CXCR7는 이전 또한 보였다 CXCR4와 heterodimers 형성 수¹⁸이 후자의 수용 체 신호 속성을 변조 함으로써. 세포내 캘리포니아^{2 +} CXCR4 중재의 수준에 있는 동요는 CXCR4 로드 모니터링 fluo-2 acetoxymethyl (오전) 에스테 르, 셀 침투성 높은 선호도 형광 캘리포니아^{2 ++} 세포-염료를 바인딩. Fluo-2 오전은 490에서 흥분 수 단일 파장 형광 분자 nm의 방출 형광 520에서 측정 하는 동안 nm. 캘리포니아^{2 +} 바인딩을 사이 Ca^{2 +}넓은 동적 범위에 따라 증가 하는이 방출 형광-바운드 및 언바운드 상태. 형광 신호 증가, 몇 분의 시간 간격 내에서 발생 하는 과도 이며 이후에 붕괴 것입니다. 수용 체 활성화의 수준으로 형광 방출 더 상호의 피크 높이입니다. 자체 분석 결과 분석 결과에 pipetting 단계 표준화를 수 있는 통합된 pipetting 시스템을 보유 하 고 있는 강화 CCD (ICCD) 카메라를 갖춘 형광 microplate 리더를 사용 하 여 수행 됩니다 ( 재료의 표참조) . 또한, 형광 신호는 미 판의 모든 우물에서의 동시 측정에 사용 되는 형광 판독기의 또 다른 주요 장점은입니다. 첫 번째는 동안 조사 (예를 들어, 고정된 농도에 또는 희석 시리즈에 작은 분자의 패널) 화합물 fluo-2 오전에 추가 분석 결과의 부분 로드 CXCR4⁺ U87 셀 뒤에 ~ 10 분 잠복기 화합물의 잠재적인 agonistic 효과 지속적으로 실시간으로 측정 됩니다. 그런 다음에 생 길 항 제 (즉, CXCL12) 연상 CXCR4 중재 일시적인 증가 세포내 캘리포니아^{2 +}의 수준에서 셀에 추가 됩니다. 분석 결과의이 부분 동안에 시험된 화합물의 잠재적인 대립 활동을 평가할 수 있습니다. 분석 결과 일반적인 워크플로의 도식 개요는 그림 1에 표시 됩니다.

이 Ca^{2 +} 동원 분석 결과 경쟁 CXCR4 길 항 제 (즉, 생 주 작동 근 묶는 수용 체를 자극을 방지 하는 화합물)의 억제 효능을 결정을 위해 주로 사용 되는 있지만 그것은 또한 수용 체 주 작동 근을 식별할 수 있습니다 및, 더하여, 화합물을 바인딩 allosteric 사이트 (즉, 세 생 주 작동 근에 의해 점령 orthosteric 바인딩 사이트에서 다른 사이트)에 의해 그들의 기능을 발휘. 화합물의 후반 종류의 예로 allosteric 촉진제 및 PAMs 및 NAMs^19,20있습니다. 특정 수용 체 길 항 근으로 NAMs CXCL12 유도 캘리포니아^{2 +} 응답을 억제 것, 반면 PAMs이이 응답을 향상 시킬 것 이다 (또한 토론 을 참조 하십시오 섹션). 이 방법을 적용할 수 있는 최소한의 최적화 노력으로 다른 GPCRs에 적어도 예상 된다 분석 결과 특히 대상 CXCR4 여기서 설명, 비록 그들은 세포내 캘리포니아^{2 +}의 출시를 통해 신호 하는 경우.

Protocol

참고: 섹션 1과 2에 설명 된 모든 단계는 층 류 캐비닛에 무 균 조건 하에서 수행 됩니다. 1입니다. U87의 유지 보수입니다. CD4.hCXCR4 셀 37 ° C, 5% CO2 습도 인큐베이터 T75 문화 플라스 크에 세포 성장.참고: 체 외에서 세포 라인이이 프로토콜에 사용 되는 U87 세포종 세포 라인 안정적으로 차별화 4의 클러스터 (CD4)와 인간의 표현 CXCR4 앞에서 설명한<sup class="x…

Representative Results

U87 세포내 캘리포니아2 + 동원에서 CXCL12 자극의 효과. CD4.CXCR4+ 와 U87입니다. CD4 세포 Ca2 + 동원 분석 결과와 평가 했다. 분석 결과 버퍼에 추가 되었습니다 (그림 1) 프로토콜의 첫 번째 pipetting 단계 동안 추가 됩니다 일반적으로 시험 화합물의 20 µ L, 대신 fluo-2 오전 로드 U87. CD4.CXCR4+ 측정 판에 셀. 단계에서 두 번째 분?…

Discussion

캘리포니아^{2 +}-동원 분석 결과 여기에 설명 된 이전을 식별 하 고 특성 수용 체 길 항 근 CXCR4¹⁷를 대상으로 하는 유용한 도구가 될 표시 되었습니다. 그러나 그것은,,이 방법을 적용할 수 있는 일반적으로 그들의 활성화 시 cytosolic 캘리포니아^{2 +} 릴리스를 실행 하는 다른 GPCRs의 큰 그룹에 CCR5 관련된 chemokine 수용 체에 대 한 볼 수 있듯이 예상. 반면 CCR5 경우 정확 하 …

Materials

Fluo-2 AM	Abcam	ab142775	fluorescent Ca2+ sensitive dye
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G	pluronic acid
Gelatin	Sigma	G9391
AMD3100	Sigma	A5602-5 mg	specific CXCR4 antagonist
Maraviroc	kind gift of AnorMed		antiretroviral drug, CCR5 antagonist
Chemokine ligand CXCL12	PeproTech	300-28A
Chemokine ligand CCL5	PeproTech	300-06
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco (Life Technologies)	10270-106
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A1933-25G
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Gibco (Life Technologies)	41965-039
HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red	Gibco (Life Technologies)	14065-049
HEPES (1 M)	Gibco (Life Technologies)	15630-056
Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red	Gibco (Life Technologies)	25200-056
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco (Life Technologies)	14190-094
Falcon tubes, 50 mL	Greiner Bio-One	227 261
Tissue culture flask (T75)	Corning	353024
Black plate, 96-well, clear bottom, with lid	Costar/Fisher Scientific	10530753	assay plate (96-well), for cell seeding
Polypropylene (PP) plates	Thermo Scientific (VWR)	732-2661	plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom
FLIPR Tetra high throughput cellular screening system	Molecular Devices		Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera
FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm	Molecular Devices	0200-6128	Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye
FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm	Molecular Devices	0200-6203	emission filter compatible with the fluorescent dye
FLIPR Tetra 96 Head	Molecular Devices	0310-4536	96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader
ScreenWorks	Molecular Devices		software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra
Vi-CELL	Beckman Coulter		cell viability analyzer
Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile	Corning	3340	Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate.