Un ensayo de cinética basada en fluorescencia Ca2 + movilización para identificar G proteína-juntó el Receptor agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos
Summary
El ensayo celular se describe está diseñado para la identificación del receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4)-agentes interactuantes que inhiben o estimulan, ya sea competitivo o allosterically, la intracelular Ca2 + liberación iniciada por activación de CXCR4.
Abstract
Receptores acoplados a proteína G (GPCRs) son de gran importancia para la industria farmacéutica ya que están implicados en muchas enfermedades humanas e incluyen objetivos bien validados para la intervención terapéutica. Descubrimiento de compuestos de plomo, incluyendo pequeñas moléculas sintéticas, que inhiben específicamente la función del receptor, es un paso inicial importante en el desarrollo de fármacos y se basa en ensayos de la célula sensibles, específicos y sólidos. Aquí, describimos un análisis celular cinético con una lectura fluorescente diseñada principalmente para identificar los antagonistas específicos de receptores que inhiben la Ca2 + liberación intracelular evocada la activación de los receptores de quimiocina CXC 4 (CXCR4) por su ligando endógeno, el ligando de quimiocina CXC 12 (CXCL12). Una ventaja clave de este método es que además, permite la detección de compuestos con propiedades agonistas intrínsecas (es decir, compuestos que un aumento de Ca2 + concentración intracelular en la ausencia de CXCL12) o compuestos modulación de la función del receptor vía la interacción con sitios de Unión alostérica (es decir, moduladores alostéricos positivos y negativos (PAMs y NAMs, respectivamente)). En el lado de abajo, autofluorescent compuestos interfieren con la lectura del ensayo, así dificultando la interpretación de datos confiable. Más probable es que este análisis pueden aplicarse, con adaptaciones mínimas, como un ensayo de descubrimiento de medicamentos genéricos para muchos otros GPCRs que la activación conduce a una liberación de Ca intracelular2 +.
Introduction
GPCRs son una superfamilia importante de proteínas de la superficie celular que activan cascadas de transducción de la señal al ligando extracelular. Pueden activarse por una gran variedad de estímulos incluyendo péptidos, hormonas proteicas, aminas biógenas y lípidos, que da lugar a la iniciación de diversas vías de señalización intracelular y respuestas biológicas eventualmente1,2 . Además, GPCRs participan en muchos, si no todos, los procesos fisiológicos y de desarrollo y muchas enfermedades humanas están asociadas con sobreexpresión de señalización o receptores GPCR disfuncional. GPCRs son por lo tanto entre los objetivos farmacológicos validados más en medicina1,3.
Por lo general, un flujo de trabajo de descubrimiento de drogas GPCR comienza con ensayos de proyección celular que permite la identificación de compuestos como moléculas pequeñas, anticuerpos monoclonales, péptidos que pueden modular la actividad de un particular GPCR. En el descubrimiento de la droga GPCR existen diferentes tipos de ensayos para buscar dichos compuestos, la mayoría de los cuales es compatible con campañas de proyección de rendimiento medio a alto. Los ensayos más usados incluyen experimentos de unión del receptor, fluorescencia o luminiscencia basado en análisis de detección de fluctuaciones en el nivel de supuestos mensajeros secundarios (p. ej., Ca2 +, monofosfato de adenosina cíclico (AMP)) fenotípicas ensayos de selección y reclutamiento de β-arrestin ensayos de4. La elección de un tipo particular de análisis puede depender de múltiples factores, pero también está determinada por el conocimiento previo de las propiedades de la señalización de un GPCR dado. Agonista a un GPCR induce un cambio conformacional que catalizan el intercambio de difosfato de guanidina (PIB) para el trifosfato de guanidina (GTP) en la subunidad α de las proteínas heterotriméricas G. Posteriormente la subunidad Gα-GTP se disocia de la subunidadβγ de G y ambas subunidades iniciará otras vías de señalización. Hidrólisis de la molécula de GTP y posterior re-Asociación de laαde la G / PIB y Gβγ subunidades restaurará la proteína G en su conformación inactiva5,6. Basado en la semejanza de la secuencia de la subunidadα G se definen diferentes tipos de proteínas G (GsGGq, G12/13)7. Señalización mediante elα de la G subunidad da lugar a varias respuestas típicas tales como el aumento (a través de Gs) o disminuir (via G) de la producción de AMP cíclico y Ca2 + movilización intracelular (via Gq)5 ,7. Gβγ subunidades también son capaces de inducir las vías efectoras intracelulares. Por ejemplo, en la activación de la G-GPCRs juntados, Gβγ pueden estimular directamente la fosfolipasa C (PLC-β) para producir trifosfato de inositol (IP3) que desencadena la liberación de Ca2 + intracelular tiendas7 . Tras la activación del receptor, GPCRs son fosforilados por las kinasas GPCR (GRKs) que promueve la interacción con β-arrestins. Este proceso termina G proteína de señalización y conduce a la internalización y la desensibilización del receptor. Β-arrestins también son capaces de formar complejos moleculares múltiples que pueden desencadenar otras vías de señalización independientes de la proteína G señalización8.
Dentro de la subfamilia de receptores del chemokine, la G-CXCR4 acoplado es un GPCR que ha levantado mucho interés como un prometedor objetivo de descubrimiento de fármacos. Dado su papel establecido como un co-receptor importante para virus de inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1) entrada viral e infección, compuestos dirigidos a CXCR4 se desarrollaron inicialmente como de los candidatos de drogas anti-VIH9. Más recientemente, un creciente cuerpo de evidencia ha señalado a un papel importante para CXCR4 en tumorigenesis y cáncer metástasis convirtiéndolo en un objetivo terapéutico validado en oncología, así10. CXCR4 es altamente expresada en más de veinte tipos de cáncer en humanos y controles tumor celular supervivencia, proliferación y migración así como angiogénesis tumorales10. Antagonistas CXCR4 de diferentes clases químicas previamente han sido descritas11,12, pero sólo la molécula pequeña que AMD3100 es actualmente aprobado para su uso en la clínica como un agente de movilización de células madre utilizado durante el tratamiento del linfoma y mieloma pacientes13,14. Los ensayos clínicos están en curso para evaluar la seguridad y la eficacia de varios otros antagonistas CXCR4 en diferentes enfermedades humanas, pero con un fuerte enfoque en oncología12. Habida cuenta de las muchas aplicaciones posibles para los antagonistas CXCR4, se justifica la búsqueda de nuevos compuestos con propiedades farmacocinéticas mejoradas, mejor biodisponibilidad o potencialmente menos efectos secundarios.
Aquí, un análisis cinético de celular basado en fluorescencia se utiliza principalmente para pantalla de compuestos capaces de inhibir la CXCR4 se describe. La medición fluorescente de este método se basa en el transitorio aumento de la Ca2 + concentración intracelular evocado en la activación de CXCR4 por su agonista endógeno, el ligando de la QUIMIOCINA CXCL12 (anteriormente conocido como células estromales derivan factor 1α ( SDF1-α)) y la potencial inhibición de esta CXCL12-inducida de Ca2 + respuesta de compuestos particulares. En este ensayo, se utilizan células de glioblastoma humano U87 estable expresando el receptor CXCR4 humano. Al mismo tiempo, estas células carecen de expresión endógena de CXCR7, un receptor de chemokine relacionados que también une CXCL1215,16,17. CXCR7 ha también ha demostrado previamente para ser capaces de formar heterodímeros con CXCR4, tal modo modulando las señalización características de este último receptor18. Fluctuaciones en el nivel intracelular Ca2 + mediada por CXCR4 son monitoreadas por la carga de la CXCR4+ células con éster de fluo-2 acetoxymethyl (AM), una afinidad alta permeable a la célula fluorescente Ca2 +-enlace colorante. Fluo-2 AM es una molécula fluorescente de longitud de onda única que puede ser excitada a 490 nm mientras que la fluorescencia de emisión se mide a 520 nm. Esta fluorescencia de emisión aumenta al Ca2 + enlace, con un amplio rango dinámico entre el Ca2 +-atado y desatado el estado. El aumento de la señal fluorescente es transitorio, que ocurre dentro de un intervalo de tiempo de unos pocos minutos y luego decaerá. La altura de la emisión fluorescente más correlaciona con el nivel de activación del receptor. El ensayo sí mismo se realiza mediante un lector de microplacas de fluorescencia equipado con una cámara CCD intensificado (ICCD) que posee un sistema de pipeteado integrado que permite la estandarización de los pasos de pipeteo en el análisis (véase Tabla de materiales) . Además, la medida simultánea de la señal fluorescente en todos los pocillos de una microplaca es otra ventaja clave del lector de fluorescencia que se utiliza. Durante la primera parte del análisis de los compuestos en investigación (por ejemplo, un grupo de pequeñas moléculas a una concentración fija o en una serie de diluciones) se agregan a la fluo-2 AM cargado CXCR4+ U87 células seguida de un ~ 10 minutos de incubación durante el cual el potencial efecto agonístico de los compuestos se mide continuamente en tiempo real. Entonces, el agonista endógeno (es decir, CXCL12) se agrega a las células para evocar un aumento transitorio en el nivel de Ca intracelular2 +CXCR4-mediated. Durante esta parte del análisis se puede evaluar la potencial actividad antagonista de los compuestos probados. Una descripción esquemática de flujo de trabajo general del ensayo se presenta en la figura 1.
Aunque este ensayo movilización de Ca2 + se ha utilizado principalmente para identificar y determinar la potencia inhibitoria de competencia antagonistas CXCR4 (es decir, compuestos que impiden que el agonista endógeno para enlazar y estimular el receptor), también puede identificar agonistas del receptor y, además, compuestos que ejercen su función uniéndose a sitios alostéricos (es decir, sitios que topográficamente el sitio de unión de orthosteric ocupado por el agonista endógeno). Ejemplos de esta última categoría de compuestos son agonistas alostéricos y PAMs y NAMs19,20. Mientras que los antagonistas específicos del receptor así como NAMs inhibiría la respuesta de CXCL12-inducida de Ca2 + , PAMs mejoraría esta respuesta ( véase también sección). Aunque el ensayo descritos específicamente objetivos CXCR4, se prevé que este método puede ser aplicado a otros GPCRs con esfuerzo mínimo de optimización, por lo menos si la señal a través de la liberación de Ca intracelular2 +.
Protocol
Representative Results
Discussion
El Ca2 +-ensayo de movilización descrito anteriormente ha demostrado ser una herramienta valiosa para identificar y caracterizar a los antagonistas del receptor CXCR417de focalización. Es, sin embargo, anticipó que este método puede ser aplicado más generalmente a un grupo grande de otros GPCRs que desencadenan una citosólica Ca2 + liberación tras su activación, como se ilustra para el receptor del chemokine relacionados con CCR5. Mientras que en el caso de CCR5 podr?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Eric Fonteyn y Geert Schoofs excelente asistencia técnica. Este trabajo ha sido apoyado por el KU Leuven (subsidio no. PF/10/018), el Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, subsidio no. G.485.08) y la Fundación Dormeur Vaduz.
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
Riferimenti
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D’Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. . Chemokine Biology – Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).
