Bir Kinetik Floresans tabanlı Ca2 + seferberlik tahlil G Protein birleştiğinde reseptör agonistleri, antagonistleri ve Allosteric modülatörler tanımlamak için
Summary
Açıklanan hücresel tahlil CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) tanımlanması için tasarlanmıştır-inhibe veya teşvik, rekabetçi veya allosterically, CXCR4 etkinleştirme tarafından başlatılan intrasellüler Ca2 + serbest etkileşen aracıları.
Abstract
Onlar birçok insan hastalıkları içinde yer alan ve terapötik müdahale için iyi doğrulanmış hedefleri içerir gibi ilaç endüstrisi için büyük önem G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) vardır. Keşif kurşun bileşikleri, özellikle reseptör’ın işlevi inhibe, küçük sentetik moleküller de dahil olmak üzere uyuşturucu gelişiminde önemli bir ilk adımdır ve hassas, belirli ve güçlü hücre tabanlı deneyleri üzerinde dayanır. Burada, biz Kinetik bir hücresel tahlil ile öncelikle CXC Kemokin reseptör 4 (CXCR4) etkinleştirme uyarılmış intrasellüler Ca2 + serbest inhibe özel reseptör antagonistleri tanımlamak için tasarlanmış bir floresan okuma tarafından açıklamak onun endojen ligand CXC Kemokin ligand 12 (CXCL12). Ayrıca tarama Iç agonistik özellikleri (örneğin, intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu yokluğunda CXCL12 bir artış alabilme bileşikleri) veya bileşikler ile donatılmış bileşiklerin sağlar Bu yöntemin önemli bir avantajı olduğunu reseptör’ın işlevi allosteric bağlayıcı siteleri ile etkileşim yoluyla oransal (Yani, pozitif ve negatif allosteric modülatörler (PAMs ve NAMs, sırasıyla)). Aşağı tarafta, autofluorescent bileşikler böylece güvenilir veri yorumu engelleyici tahlil’ın okuma ile etkileşebilir. Büyük olasılıkla bu tahlil, en az uyarlamalar ile jenerik ilaç keşif tahlil için birçok diğer GPCRs hangi bir intrasellüler Ca2 +serbest bırakmak için belgili tanımlık harekete geçirmek yol olarak uygulanabilir.
Introduction
GPCRs önemli bir üst aile cep yüzey proteinlerin sinyal iletim cascades ekstraselüler ligand taşıması üzerine harekete geçirmek vardır. Çeşitli hücre içi sinyal yolları ve sonunda biyolojik yanıt-e doğru1,2 başlatma sonuçları uyaranlara peptidler, protein hormonlar, Biojenik aminler ve lipidler, dahil olmak üzere büyük bir çeşitlilik tarafından etkinleştirilebilir . Ayrıca, GPCRs birçok, eğer tüm, gelişimsel ve fizyolojik süreçler söz konusu ve birçok insan hastalıkları işlevsiz GPCR sinyal veya reseptör overexpression ile ilişkilidir. GPCRs bu nedenle tıp1,3en doğrulanmış farmakolojik hedefler arasında bulunmaktadır.
Genellikle, küçük moleküller, Monoklonal antikor ve belirli bir GPCR etkinlik modüle peptidler gibi bileşiklerin kimliği etkinleştirme hücresel tarama deneyleri GPCR ilaç keşif iş akışı başlar. GPCR ilaç keşfi, böyle bileşikler için aramak için farklı türlerde deneyleri mevcut olan en orta – için yüksek-den geçerek tarama kampanyaları ile uyumludur. En çok kullanılan deneyleri reseptör bağlama deneyler, dahil floresan veya ışıldama göre sözde ikincil haberci (örneğin, Ca2 +, siklik adenozin monofosfattır (AMP)), fenotipik düzeyde dalgalanması tespit deneyleri tarama testleri ve β-arrestin işe alım deneyleri4. Tahlil belirli bir türü için seçim birden fazla faktöre bağlı olabilir, ama aynı zamanda belirli bir GPCR sinyal özellikleri ile ilgili ön bilgi tarafından belirlenir. Bir GPCR bağlama agonist guanidin nükleotittir (GSYİH) guanidin trifosfat (GTP) için exchange katalizlerler konformasyonal değişim α-alt heterotrimeric G protein neden olmaktadır. Daha sonra Gα-GTP alt birimi Gβγ alt birimi ayrışıp ve her iki alt birimleri daha fazla sinyal yolları başlatacaktır. Hidroliz GTP-molekül ve sonraki yeniden Derneği Gα– GSYİH ve Gβγ alt birimleri gr protein onun etkin olmayan uyum5,6geri yükler. Dayalı sıra Gα alt birim benzerliğini G proteinlerin farklı türleri tanımlanmıştır (Gs,benG, Gq, G12/13)7. Via Gα sinyal alt birimi verir artış artış gibi birkaç tipik yanıt için (Gs) veya (Gben) siklik AMP üretim ve intrasellüler Ca2 + seferberlik (yolu ile Gq) azaltmak5 ,7. Gβγ alt birimleri Ayrıca hücre içi efektör yolları ikna edebiliyoruz. Örneğin,benG aktivasyonu üzerine-eşleşmiş GPCRs, Gβγ doğrudan fosfolifaz açıklaması, Ca2 + hücre içi mağazaları7 tetikleyen C (PLC-β) inositol trifosfat (IP3) üretmek için teşvik . Reseptör aktivasyonu, β-arrestins ile etkileşimi teşvik GPCR kinaz (GRKs) tarafından GPCRs fosforile. Bu işlem G protein sinyal sonlandırır ve reseptör duyarsızlaştırma ve sonunda içselleştirilmesi yol açar. Β-arrestins da diğer sinyal yolları8sinyal G protein bağımsız tetikleyebilir çok moleküler komplekslerin oluşturmak edebiliyoruz.
Kemokin reseptörleri, Gbenalt familya içinde-eşleşmiş CXCR4 çok ilgi ilaç keşfi için umut verici hedef olarak yükseltti GPCR olduğunu. İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) 1 için büyük bir co reseptör olarak kurulan rolünü verilen viral giriş ve enfeksiyon, CXCR4 hedefleme bileşikler başlangıçta Anti-HIV ilaç adayları9olarak geliştirilmiştir. Daha yakın zamanlarda, kanıt büyüyen bir vücut için önemli bir rol CXCR4 için yapım o iyi doğrulanmış bir terapötik hedef Onkoloji de tumorigenesis ve kanser metastaz içinde10işaret etmiştir. CXCR4 son derece insan kanseri ve denetimleri tümör hücre sağkalım, nükleer silahların yayılmasına karşı ve geçiş yanı sıra angiogenez tümör ile ilgili10yirmiden fazla türünde de ifade edilir. Farklı kimyasal sınıfların CXCR4 antagonistleri daha önce açıklanan11,12, ama sadece küçük molekül AMD3100 şu anda Lenfoma tedavi sırasında kullanılan kök hücre seferberlik ajan olarak klinikte kullanımı için onaylanan olmuştur ve Miyelom hastaları13,14. Klinik çalışmalarda emniyet ve birkaç diğer CXCR4 antagonistleri farklı insan hastalıkları, ama Onkoloji12güçlü bir odaklanma ile etkinliğini değerlendirmek için devam etmektedir. Birçok potansiyel uygulama CXCR4 antagonistleri için göz önüne alındığında, geliştirilmiş farmakokinetik özellikleri, Gelişmiş bioavailability veya potansiyel olarak daha az yan etkileri ile roman bileşikler için arama garanti kapsamındadır.
Burada, Kinetik bir floresan tabanlı hücresel tahlil için öncelikle kullanılan ekran CXCR4 inhibe yeteneğine sahip bileşikler için açıklanmıştır. Bu yöntemin floresan ölçüm CXCR4 harekete geçirmek onun endojen agonist Kemokin ligand (stromal hücre türetilmiş gibi faktör 1α (eski adıyla CXCL12 tarafından uyarılmış intrasellüler Ca2 + konsantrasyonu geçici artış dayanır SDF1-α)) ve bu CXCL12 kaynaklı Ca2 + yanıt tarafından belirli bileşikler potansiyel inhibisyonu. Bu tahlil U87 insan glioblastoma hücreler stabil insan CXCR4 reseptör ifade kullanılır. Aynı zamanda, bu hücreler CXCR7, ayrıca CXCL1215,16,17bağlar ilgili Kemokin reseptör endojen ifade eksikliği. CXCR7 daha önce de heterodimers CXCR4 ile şekillendirme yeteneğine sahip olması dolayısıyla bu ikinci reseptör18sinyal özelliklerini oransal gösterilmiştir. Düzeyi tarafından CXCR4 aracılı hücre içi Ca2 + dalgalanmalar CXCR4 yükleyerek izlenir+ hücreleri ile fluo-2 acetoxymethyl (AM) ester, bir hücre geçirgen yüksek afinite floresan Ca2 +-boya bağlama. Fluo-2 490 heyecanlı bir tek dalga boyu floresan molekül olduğu kendi emisyon Floresans 520 ölçülür ise nm nm. Ca2 + bağlama, büyük bir Dinamik Aralık arasında Ca2 +ile üzerine bu emisyon Floresans artırır-bağlı ve devlet ilişkisiz. Floresan sinyal artış geçicidir, birkaç dakika, bir zaman aralığında meydana gelen ve daha sonra çürük. Floresan emisyon daha fazla ilişkilendirir pik yüksekliği reseptörü harekete geçirmek düzeyine sahip. Tahlil kendisi tahlil pipetting adımları standardizasyonu sağlayan entegre bir pipetting sistem sahip bir yoğun CCD (ICCD) kamera ile donatılmış bir floresan Mikroplaka okuyucu kullanılarak gerçekleştirilir ( Tablo malzemelerigörmek) . Buna ek olarak, aynı anda bir Mikroplaka bütün Wells floresan sinyal kullanılır Floresans okuyucu bir diğer önemli avantajı ölçümdür. İlk soruşturma (örneğin, sabit bir konsantrasyon veya bir seyreltme dizisinde küçük moleküllerin bir panel) altında bileşikler fluo-2 AM eklendi tahlil bir parçası CXCR4 yüklenen+ U87 hücreleri tarafından izlenen bir ~ 10 dk kuluçka dönemi sırasında gerçek zamanlı olarak sürekli bileşikler potansiyel agonistik etkisi ölçülür. O zaman, endojen agonist (örneğin, CXCL12) hücrelere bir CXCR4 aracılı geçici düzeyinde artış intrasellüler Ca2 +uyandırmak eklenir. Bu testin bir parçası sırasında test edilen bileşiklerin potansiyel antagonistik etkinlik değerlendirilebilir. Tahlil’ın genel iş akışı şematik bir bakış şekil 1‘ de sunulmuştur.
Bu Ca2 + seferberlik tahlil öncelikle tanımlamak ve rekabetçi CXCR4 antagonistleri (Yani, bağlama ve reseptör teşvik endojen agonist önlemek bileşikler), inhibitör potens belirlemek için yolculuklarında uygulanmış olsa o da reseptör agonistleri belirleyebilir ve buna ek olarak, maddeler ve birleşimler işlevlerine göre bağlama (Yani, arazi endojen agonist tarafından işgal orthosteric bağlama site farklı siteleri) allosteric sitelerdeki uygulamayın. Allosteric agonistleri ve PAMs ve NAMs19,20ikinci kategoriye bileşiklerin örnekleridir. NAMs yanı sıra özel reseptör antagonistleri CXCL12 kaynaklı Ca2 + yanıt inhibe ise, PAMs bu yanıtı artıracak (Ayrıca bkz: tartışma bölümü). Tahlil burada özellikle hedefleri CXCR4 açıklanan rağmen bu yöntem en az optimizasyonu çaba ile diğer GPCRs için en az uygulanabilir öngörülmektedir intrasellüler Ca2 +serbest bırakmak yolu ile isaret edersem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ca2 +-burada açıklanan seferberlik tahlil tanımlamak ve CXCR417hedefleme reseptör antagonistleri karakterize etmek için değerli bir araç olarak daha önce gösterildi. Ancak, bu yöntem daha genel olarak bir sitozolik Ca2 + serbest bırakılmasıyla onların harekete geçirmek, tetikler diğer GPCRs büyük bir grup için ilgili Kemokin reseptör CCR5 gösterildiği gibi uygulanabilir olduğunu tahmin edilmektedir. CCR5 durumunda tam olarak aynı deneysel koşullar uyg…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Eric Fonteyn ve Geert Schoofs mükemmel teknik destek için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser KU Leuven tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (iki, hayır vermek. G.485.08) ve Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
Riferimenti
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D’Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. . Chemokine Biology – Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).
